Aumentando a Durabilidade de Culturas de Células Neurais Dissociadas Usando Matriz Coralina Biologicamente Ativa
Summary
A cultura de células dissociadas do hipocampo é uma ferramenta experimental fundamental em neurociência. A sobrevivência e a função das células neurais em cultura são aumentadas quando esqueletos coralinos são usados como matrizes, devido ao seu papel neuroprotetor e neuromodulador. Assim, as células neurais cultivadas em matriz coralina apresentam maior durabilidade e, portanto, são mais adequadas para o cultivo.
Abstract
Culturas de células neuronais e gliais do hipocampo dissociadas são um modelo experimental valioso para estudar o crescimento e a função neural, proporcionando alto isolamento celular e um ambiente controlado. No entanto, a sobrevivência das células do hipocampo in vitro está comprometida: a maioria das células morre durante a primeira semana de cultivo. Portanto, é de grande importância identificar maneiras de aumentar a durabilidade das células neurais em cultura.
O carbonato de cálcio na forma de aragonita cristalina derivada do esqueleto de corais pode ser usado como uma matriz ativa superior para culturas neurais. Ao nutrir, proteger e ativar as células gliais, o esqueleto do coral aumenta a sobrevivência e o crescimento dessas células in vitro melhor do que outras matrizes.
Este protocolo descreve um método para cultivar células hipocampais em uma matriz coralina. Essa matriz é gerada pela fixação de grãos de esqueletos de corais em pratos de cultura, frascos e lamínulas de vidro. Os grãos ajudam a melhorar o ambiente das células, introduzindo-as em um ambiente tridimensional fino (3D) para crescer e formar estruturas semelhantes a tecidos. O ambiente 3D introduzido pelo esqueleto do coral pode ser otimizado para as células por moagem, o que permite o controle sobre o tamanho e a densidade dos grãos (ou seja, a rugosidade da matriz), uma propriedade que foi encontrada para influenciar a atividade das células gliais. Além disso, o uso de grãos facilita a observação e análise das culturas, principalmente quando se utiliza microscopia de luz. Assim, o protocolo inclui procedimentos para geração e otimização da matriz coralina como ferramenta para melhorar a manutenção e funcionalidade das células neurais in vitro.
Introduction
Culturas de células neurais dissociadas, neste caso células hipocampais, são um valioso modelo experimental para o estudo do crescimento e função neural, proporcionando alto isolamento celular e acessibilidade 1,2,3. Esse tipo de cultura é frequentemente utilizado em neurociências, desenvolvimento de fármacos e engenharia de tecidos devido à grande quantidade de informações que podem ser coletadas, tais como taxas de crescimento e viabilidade, neurotoxicidade, crescimento e rede de neuritos, conectividade e plasticidade sináptica, modificações morfológicas, organização e fiação de neuritos, etc.1,4,5,6,7.
Apesar da importância das culturas, as células cultivadas são geralmente forçadas a crescer sobre lamínulas de vidro em uma monocamada bidimensional. Essas modificações ambientais estritas diminuem significativamente a capacidade de sobrevivência das células neurais ao longo do tempo, pois as lamínulas de vidro são substratos não nutritivos com baixa força de adesão, exibindo menor capacidade de suportar o crescimento celular 8,9,10,11.
Como as células neurais cultivadas são forçadas a crescer em condições desafiadoras, uma abordagem essencial para aumentar sua sobrevivência seria imitar ao máximo seu ambiente natural12,13. Isso poderia ser obtido com o uso de biomateriais que atuarão como matrizes e mimetizarão a matriz extracelular das células, permitindo que elas formem uma estrutura semelhante a um tecido e auxiliem na sua nutrição14.
O uso de biomateriais é uma abordagem promissora no aprimoramento de culturas celulares, pois atuam como arcabouços biocompatíveis, proporcionando estabilidade mecânica e melhorando uma variedade de propriedades celulares, incluindo adesão, sobrevivência, proliferação, migração, morfogênese e diferenciação15,16,17. Vários tipos de biomateriais são utilizados para melhorar as condições das células in vitro. Entre eles estão os biopolímeros, ou componentes biológicos que geralmente fazem parte da matriz extracelular das células. Esses biomateriais são utilizados principalmente como forma de agentes polimerizados de revestimento ou hidrogéis18,19,20. Por um lado, as matrizes citadas acima conferem às células um ambiente 3D familiar para crescer, estimulam sua adesão ao prato e lhes dão suporte mecânico21,22. Por outro lado, sua forma polimerizada e o confinamento das células dentro de hidrogéis perturbam o acesso das células aos componentes nutritivos presentes nos meios de crescimento e também dificultam o acompanhamento das células por métodos microscópicos23.
Exoesqueletos de corais são matrizes biológicas de origem marinha. Eles são feitos de carbonato de cálcio, têm estabilidade mecânica e são biodegradáveis. Estudos prévios utilizando o esqueleto de coral como matriz para o crescimento de células neurais em cultura mostraram adesão muito maior, em comparação com lamínulas de vidro24,25. Além disso, células neurais cultivadas no esqueleto do coral demonstraram sua capacidade de ingerir o cálcio do esqueleto composto, o que protege as células neurais em condições de privação de nutrientes26. Além disso, o esqueleto do coral é uma matriz de suporte e nutrição que aumenta a sobrevivência das células neurais, estimula a formação de redes neurais, eleva a taxa de conectividade sináptica e possibilita a formação de estruturas semelhantes a tecidos27,28. Estudos recentes também têm demonstrado que a topografia superficial da matriz do esqueleto coral desempenha um papel crucial na distribuição e ativação das célulasgliais8,29. Além disso, o esqueleto de coral é eficaz como matriz para o cultivo de outros tipos celulares, como osteócitos30,31, hepatócitos e cardiomiócitos em cultura (dados não publicados).
Assim, o esqueleto de corais é uma matriz promissora para o cultivo de células in vitro. Assim, o protocolo detalhado a seguir descreve a técnica de cultivo de células neurais no esqueleto de corais para a produção de culturas neurais mais estáveis e prósperas do que aquelas alcançadas pelos métodos existentes. Esse protocolo também pode ser útil para o cultivo de cardiomiócitos, hepatócitos e outros tipos celulares.
Protocol
Representative Results
Discussion
A técnica aqui apresentada descreve uma maneira de melhorar a manutenção e funcionalidade de células neurais em cultura. Isto é conseguido através da adesão das células a uma matriz feita de grãos de esqueleto de coral que nutre as células e promove o seu crescimento e atividade. O uso dessa técnica aumenta a capacidade do modelo de cultura neural de imitar o ambiente das células no cérebro.
A introdução da matriz como substrato de cultura apresenta diversas vantagens sobre outr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo programa KAMIN do Ministério do Comércio e Trabalho de Israel e pela Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, EUA.
Materials
| 24-well plates | Greiner | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | #A4503 | |
| D – glucose | Sigma | #G8769 | |
| Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) | Sigma | #D5796 | |
| Electrical sieve | Ari Levy | #3700 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Biological Industries | #04-007-1A | |
| First Day Medium | 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose. | ||
| Flasks | Greiner | #60-690160 | 25cm^2, Tissue culture treated |
| Fluoro-deoxy-uridine | Sigma | #F0503 | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | Romical | #007130-72-19 | Hazardous |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S solution | Sigma | #H6648 | |
| Kynurenic acid | Sigma | #K3375 | |
| L – glutamine | Sigma | #G7513 | |
| Manual strainer (40µm) | VWR | #10199-654 | |
| Minimun Essential Eagle (MEM) | Sigma | #M2279 | |
| Mortar and pestle | De-Groot | 4-P090 | |
| NaClO (Sodium Hypochlorite) | Sigma | #425044 | Hazardous |
| NaOH | Sigma | #S8045 | Hazardous |
| Neuronal Growth Medium | 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine. | ||
| Petri dish | Greiner | #60-628160, #60-627160 | 60mm, 35mm, respectively. |
| Poly D – Lysine | Sigma | #P7280 | |
| Smart Dentin Grinder | KometaBio | #GR101 | |
| Trypsin | Gibco | #15-090-046 | |
| Uridine | Sigma | #U3750 |
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