생물학적 활성 Coralline Matrix를 사용한 해리 된 신경 세포 배양의 내구성 향상
Summary
해리 된 해마 세포 배양은 신경 과학에서 중추적 인 실험 도구입니다. 산호 골격이 신경 보호 및 신경 조절 역할로 인해 매트릭스로 사용될 때 배양에서 신경 세포 생존과 기능이 향상됩니다. 따라서 산호 기질에서 자란 신경 세포는 더 높은 내구성을 나타내므로 배양에 더 적합합니다.
Abstract
해리된 해마 신경 세포 및 신경교 세포의 배양은 높은 세포 격리와 통제된 환경을 제공함으로써 신경 성장 및 기능을 연구하기 위한 귀중한 실험 모델입니다. 그러나, 시험관 내에서 해마 세포의 생존은 손상된다 : 대부분의 세포는 배양 첫 주 동안 죽는다. 따라서 배양에서 신경 세포의 내구성을 높이는 방법을 식별하는 것이 매우 중요합니다.
산호의 골격에서 유래 한 결정질 아라고나이트 형태의 탄산 칼슘은 신경 배양을위한 우수한 활성 매트릭스로 사용될 수 있습니다. 신경교 세포를 육성, 보호 및 활성화함으로써 산호 골격은 다른 매트릭스보다 시험관 내에서 이러한 세포의 생존과 성장을 더 잘 향상시킵니다.
이 프로토콜은 산호 매트릭스에서 해마 세포를 배양하는 방법을 설명합니다. 이 매트릭스는 산호 골격 알갱이를 배양 접시, 플라스크 및 유리 커버 슬립에 부착하여 생성됩니다. 곡물은 세포를 미세한 3차원(3D) 환경에 도입하여 성장하고 조직과 같은 구조를 형성함으로써 세포의 환경을 개선하는 데 도움이 됩니다. 산호 골격에 의해 도입 된 3D 환경은 분쇄를 통해 세포에 최적화 될 수 있으며, 이는 신경교 세포 활동에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 특성 인 입자의 크기와 밀도 (즉, 매트릭스 거칠기)를 제어 할 수 있습니다. 또한, 곡물을 사용하면 특히 광학 현미경을 사용할 때 배양을 더 쉽게 관찰하고 분석할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜에는 시험관 내에서 신경 세포의 유지 및 기능을 개선하기 위한 도구로서 산호 매트릭스의 생성 및 최적화를 위한 절차가 포함됩니다.
Introduction
해리된 신경 세포(이 경우 해마 세포)의 배양은 높은 세포 분리 및 접근성을 제공함으로써 신경 성장 및 기능을 연구하기 위한 귀중한 실험 모델입니다 1,2,3. 이러한 유형의 배양은 성장 및 생존 속도, 신경 독성, 신경 돌기 성장 및 네트워킹, 시냅스 연결 및 가소성, 형태 학적 변형, 신경 돌기 조직 및 배선 등과 같이 수집 할 수있는 많은 양의 정보로 인해 신경 과학, 약물 개발 및 조직 공학에서 자주 사용됩니다.1,4,5,6,7.
배양의 중요성에도 불구하고, 배양 된 세포는 일반적으로 2 차원 단층의 유리 커버 슬립에서 자라도록 강요됩니다. 이러한 엄격한 환경 변형은 시간이 지남에 따라 신경 세포의 생존 능력을 크게 감소시키는데, 이는 유리 커버슬립이 접착 강도가 낮고 세포 성장을 지원하는 능력이 낮기 때문입니다 8,9,10,11.
배양된 신경 세포는 어려운 조건에서 성장해야 하기 때문에 생존을 향상시키기 위한 필수적인 접근 방식은 가능한 한 자연 환경을 모방하는 것입니다12,13. 이것은 매트릭스 역할을 하고 세포의 세포외 기질을 모방하여 조직과 같은 구조를 형성하고 영양을 공급할 수 있도록 하는 생체 재료를 사용하여 달성할 수 있습니다14.
생체 재료의 사용은 생체 적합성 스캐폴드의 역할을 하고 기계적 안정성을 제공하며 접착, 생존, 증식, 이동, 형태 형성 및 분화를 포함한 다양한 세포 특성을 향상시키기 때문에 세포 배양을 개선하는 유망한 접근 방식입니다15,16,17. 시험관 내에서 세포의 상태를 개선하기 위해 여러 유형의 생체 재료가 사용됩니다. 그 중에는 생체 고분자 또는 일반적으로 세포의 세포 외 기질의 일부인 생물학적 성분이 있습니다. 이러한 생체 재료는 주로 중합 코팅제 또는 하이드로겔의 형태로 사용된다(18,19,20). 한편, 위에서 언급한 매트릭스는 세포가 성장할 수 있는 친숙한 3D 환경을 제공하고, 접시에 대한 접착을 촉진하며, 기계적 지지를 제공합니다(21,22). 반면에, 이들의 중합 된 형태와 하이드로 겔 내 세포의 감금은 성장 배지에 존재하는 육성 성분에 대한 세포의 접근을 방해하고 또한 미세한 방법에 의한 세포의 후속 조치를 더 어렵게 만든다23.
산호 외골격은 생물학적 해양 기원 매트릭스입니다. 탄산칼슘으로 만들어졌으며 기계적 안정성이 있으며 생분해성이 있습니다. 산호 골격을 배양에서 성장하는 신경 세포의 매트릭스로 사용한 이전 연구에서는 유리 커버 슬립에 비해 훨씬 더 큰 접착력을 보여주었습니다24,25. 또한, 산호 골격에서 자란 신경 세포는 골격을 구성하는 칼슘을 섭취하는 능력을 입증했으며, 이는 영양 결핍 상태에서 신경 세포를 보호한다26. 또한, 산호 골격은 신경 세포의 생존을 증가시키고, 신경망의 형성을 촉진하고, 시냅스 연결의 속도를 높이고, 조직과 같은 구조의 형성을 가능하게하는지지 및 양육 매트릭스입니다27,28. 최근 연구에 따르면 산호 골격 매트릭스의 표면 지형은 신경교 세포의 분포와 활성화에 중요한 역할을 합니다 8,29. 또한, 산호 골격은 배양에서 골세포30,31, 간세포 및 심근 세포와 같은 다른 세포 유형의 배양을위한 매트릭스로서 효과적이다 (미공개 데이터).
따라서 산호 골격은 시험관 내에서 세포 배양을위한 유망한 매트릭스입니다. 따라서 아래에 자세히 설명 된 프로토콜은 기존 방법으로 달성 한 것보다 더 안정적이고 번영하는 신경 배양을 생산하기 위해 산호 골격에서 신경 세포를 배양하는 기술을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 심근 세포, 간세포 및 다른 세포 유형의 배양에 유용 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 기술은 배양에서 신경 세포의 유지 및 기능을 향상시키는 방법을 설명합니다. 이것은 세포를 키우고 성장과 활동을 촉진하는 산호 골격 알갱이로 만들어진 매트릭스에 세포를 부착함으로써 달성됩니다. 이 기술을 사용하면 뇌의 세포 환경을 모방하는 신경 배양 모델의 능력이 증가합니다.
배양 기질로서 매트릭스의 도입은 고전적인 신경 세포 배양 방법에 사?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 이스라엘 무역 노동부의 KAMIN 프로그램과 Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, US에서 자금을 지원했습니다.
Materials
| 24-well plates | Greiner | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | #A4503 | |
| D – glucose | Sigma | #G8769 | |
| Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) | Sigma | #D5796 | |
| Electrical sieve | Ari Levy | #3700 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Biological Industries | #04-007-1A | |
| First Day Medium | 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose. | ||
| Flasks | Greiner | #60-690160 | 25cm^2, Tissue culture treated |
| Fluoro-deoxy-uridine | Sigma | #F0503 | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | Romical | #007130-72-19 | Hazardous |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S solution | Sigma | #H6648 | |
| Kynurenic acid | Sigma | #K3375 | |
| L – glutamine | Sigma | #G7513 | |
| Manual strainer (40µm) | VWR | #10199-654 | |
| Minimun Essential Eagle (MEM) | Sigma | #M2279 | |
| Mortar and pestle | De-Groot | 4-P090 | |
| NaClO (Sodium Hypochlorite) | Sigma | #425044 | Hazardous |
| NaOH | Sigma | #S8045 | Hazardous |
| Neuronal Growth Medium | 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine. | ||
| Petri dish | Greiner | #60-628160, #60-627160 | 60mm, 35mm, respectively. |
| Poly D – Lysine | Sigma | #P7280 | |
| Smart Dentin Grinder | KometaBio | #GR101 | |
| Trypsin | Gibco | #15-090-046 | |
| Uridine | Sigma | #U3750 |
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