Summary
Her beskriver vi en pålidelig metode til måling af mitokondriel masse og membran potentiale i ex vivo kulturperler hæmatopoietiske stamceller og T-celler.
Abstract
En fin balance mellem quiescence, selvfornyelse, og differentiering er nøglen til at bevare den hæmatopoietiske stamcelle (HSC) pulje og opretholde livslang produktion af alle modne blodlegemer. I de seneste år cellulære metabolisme er dukket op som en afgørende regulator af HSC funktion og skæbne. Vi har tidligere påvist, at graduering af mitokondrie metabolisme påvirker HSC skæbne. Specifikt ved kemisk frakobling af elektrontransportkæden var vi i stand til at opretholde HSC-funktion under kulturforhold, der normalt inducerer hurtig differentiering. Begrænsning af HSC-numre udelukker imidlertid ofte brugen af standard analyser til måling af HSC-metabolisme og forudser derfor deres funktion. Her rapporterer vi en simpel flow flowcytometri assay, der giver pålidelig måling af mitokondriel membran potentiale og mitokondrie masse i knappe celler som hscs. Vi diskuterer isolering af HSCs fra mus knoglemarv og måling af mitokondrie masse og membran potentiel post ex vivo kultur. Som et eksempel viser vi moduleringen af disse parametre i HSCs via behandling med en metabolisk modulator. Desuden udvider vi anvendelsen af denne metode på humane perifere blod afledte T-celler og humane tumor infiltrerende lymfocytter (TILs), der viser dramatiske forskelle i deres mitokondrielle profiler, der muligvis afspejler forskellige T-celle Funktionalitet. Vi mener, at denne analyse kan anvendes i screeninger til at identificere modulatorer af mitokondrie metabolisme i forskellige celletyper i forskellige sammenhænge.
Introduction
Hæmatopoietiske stamceller (HSCs) er en lille population af celler bosat i knoglemarven sikre blod produktion og homøostase i hele organismens levetid. Hscs mægle denne proces ved at give anledning til stamceller, der igen producerer terminalt differentieret modne blodlegemer nedstamningens via flere runder af celledeling og godt orkestreret differentiering trin1. Det er vigtigt, at HSCs producerer deres energi via anaerob glycolyse. I modsætning hertil, mere engagerede og aktive hæmatopoietiske progenitorer skifte deres stofskifte mod mitokondrie metabolisme2,3,4. Denne særskilte metaboliske tilstand menes at beskytte hscs fra cellulære skader påført af reaktive oxygenarter (ros) produceret af aktive mitokondrier, og derved opretholde deres langsigtede in vivo funktion5,6,7,8. Direkte måling af HSC metaboliske tilstand er udfordrende og ofte lav gennemløb på grund af deres begrænsede antal. Her beskriver vi en flow cytometry-baseret analyse for robust måling af mitokondriel membran potentiale (ΔΨm) ved hjælp af tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) Fluorescens, og mitokondrie masse ved hjælp af en grøn fluorescerende mitokondrie bejdset (Mitotracker grøn) i HSCs. Vi har tidligere påvist, at Low ΔΨm er en bona fide funktionel markør af højt rensede hscs9 og metaboliske modulatorer, der kan sænke ΔΨm forbedre hscs funktion9,10. Her foreslår vi brug af vores metode på hscs mitokondrie profilering som strategi til at identificere nye molekyler, som kan forbedre hscs ' langsigtede potentiale for rekonstitution af blodet.
Som et eksempel viser vi, at denne analyse pålideligt måler sænkningen af HSC ΔΨm ved udsættelse for vitamin B3 analog nicotinamid riboside (NR). Derfor viser vi i vores nyligt offentliggjorte undersøgelse, at NR kraftigt forbedrer blod genvinding efter transplantation i både mus og humaniseret muse systemer ved direkte at forbedre hæmatopoietisk stilk og progenitorfunktioner10. Kapaciteten af sådanne metaboliske modulatorer er af stor klinisk værdi i betragtning af, at en 25% dødelighed er forbundet med forsinkelse i blod og immun opsving i posttransplanterede patienter11,12.
Desuden, vi fremlægger bevis for, at denne metode kan anvendes til karakterisering af den metaboliske profil og funktion af humane T-celler. I de seneste år, udvikling af adoptivcelle terapi (ACT) ved hjælp af autologt tumor infiltrerende lymfocytter (TILs) er blevet den mest effektive tilgang til visse typer af fremskreden kræft med ekstremt ugunstig prognose (f. eks metastatisk melanom, hvor > 50% af patienterne reagerer på behandling og op til 24% af patienterne har fuldstændig regression)13. Men, tils husly tilstrækkelig antitumoraktivitet er vanskelige at generere14. Den omfattende spredning og stimulering, som TILs undergår under ex vivo-ekspansion, forårsager T-celle udmattelse og-senescens, der dramatisk hæmmer T-cellens antitumor respons15. Det er vigtigt, at tils ' antitumoralske kapacitet er tæt knyttet til deres metabolisme16,17 og tilgange, der har til formål at moduere metabolismen gennem hæmning af PI3K/akt-vejen, har resulteret i opmuntrende resultater18,19. Af denne grund sammenligner vi ΔΨm af T-celler afledt af mononukleære celler i perifert blod (PBMCs) og patient afledte TILs, og viser, at mindre differentierede PBMC-afledte T-celler har lavere ΔΨm og mitokondrie masse i forhold til terminalt differentierede TILs.
Vi forestiller, at denne analyse kan bruges til at identificere nye metaboliske modulatorer, der forbedrer HSC og T celle funktion via modulering af ΔΨm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter, der er beskrevet i manuskriptet, følger vores institutions retningslinjer og er udført i overensstemmelse med schweizisk lov om dyreforsøg (tilladelse: VD3194) og til forskning, der involverer humane prøver (protokol: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. hematopoietisk stamcelle ekstraktion
- Køb vildtype C57BL6/J mus og holde dem i dyre huset i mindst en uge til at reducere transport-relaterede stress.
- På dagen for forsøget, aflive musen ved hjælp af co2 kvælning.
- Spray musen med 70% ethanol til at sterilisere pels og skære åbne musen på maven ved hjælp af standard kirurgiske værktøjer, såsom dissektion saks og pincet, at skære femur og skinneben fra bagbenene.
- Fjern musklerne, der er fastgjort til femur, skinneben og bækkenet ved hjælp af et blødt papirhåndklæde, og Placer de rengjorte knogler i et 50 mL rør indeholdende PBS med 1 mM EDTA (buffer) på is.
- Spray en mørtel og Pestle med 70% ethanol og Placer den i en cellekultur hætte. Steriliser det med UV i 30 min. efter sterilisering skyl mørtel og Pestle med buffer til at fjerne spor af ethanol.
- Sæt de rene knogler med nogle buffer (~ 10 mL) i mørtel og forsigtigt knuse dem for at få knoglemarven ud i suspension. Nu, indsamle cellesuspension og passere det gennem en 70 μm celle sien i en 50 mL rør for at få en enkelt cellesuspension.
- Gentag trin 1,6, indtil alle knoglemarven er ekstraheret, og knogle resterne er blevet hvide.
- 50 mL-røret (-erne), der indeholder knoglemarv-enkelt cellesuspensionen, placeres på en centrifuge. Kør centrifugen ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °c for at pille cellerne.
- I mellemtiden, forberede 10 ml 1x RBC lysis buffer i autoklaveres destilleret vand. Opløsningen filtreres gennem et 0,22 μm filter.
- Prøverøret opsamles fra centrifugeringen, og supernatanten dekarnerer. Pipetten 1x RBC lysis buffer (tabel over materialer) på celle pellet. Dislodge pellet og forberede en homogen løsning ved pipettering op og ned et par gange. Lad røret være ved stuetemperatur i 1 – 2 min for RBC lysis at forekomme. Stop lysis processen ved at fylde røret med bufferen.
- Anbring røret på en centrifuge og spin ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c. Saml røret fra centrifugen, og afMiddel supernatanten. Resuspension af pellet ved at tilføje 10 mL buffer og filtrere opløsningen til et nyt 50 mL rør via en 70 μm celle si for at fjerne resterne på grund af RBC lysis.
- Centrifugeglasset centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c. Saml røret fra centrifugen, og afMiddel supernatanten. Resuspension af pellet i 500 μL buffer.
- Fjern en 100 μl alikvot, og opbevar den i et separat 1,5 ml rør. Tilsæt 50 μL biotin Lineage depleterende antistof cocktail fra stamfader berignings sættet (tabel over materialer) til de resterende 450 μl cellesuspension. Der inkubates ved 4 °C på en shaker i 15 min.
- Tilsæt 15 mL buffer, og centrifuger røret ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c. Saml røret fra centrifugen, og afMiddel supernatanten. Resuspension af pellet i 460 μL buffer. Fjern en 10 μl alikvot, og opbevar den i et separat 1,5 ml rør.
- Tilsæt 50 μL streptavidin magnetiske perler fra stamfader berignings sættet (tabel over materialer) til den resterende 450 μl cellesuspension. Der inkubates ved 4 °C på en shaker i 15 min.
- Tilsæt 15 mL buffer, og centrifuger røret ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c. Saml røret fra centrifugen, og afMiddel supernatanten. Resuspension af pellet i 5 mL buffer og Overfør opløsningen til et 15 mL rør.
- Tag røret til en automatiseret celle separator (tabel over materialer). Kør en vask program til at skylle og Prime slangen af celle separatoren. Anbring prøven og to opsamlings slanger på rørholderen. Udfør adskillelse ved hjælp af "Deplete" programmet. Saml de positive og negative fraktioner fra den automatiserede celle separator, når kørslen er afsluttet.
Bemærk: I mangel af en automatisk celle separator brugerne kan bruge manuelle magnetiske kolonner og tilsvarende magneter, pr brugermanualen. Brugerne bør huske på, at processen med manuel adskillelse er langsommere end den automatiserede en. Også, de manuelle kolonner er mere tilbøjelige til tilstopning. Derfor, brugere rådes til at fortynde prøven og indlæse på kolonnen langsomt. - Kassér den positive fraktion. Fyld den negative brøk slange med buffer. Centrifugeglasset centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c.
- I mellemtiden, forberede antistof mix i 1 mL af den endelige volumen opløsning og den enkelt-farve kontrol i 200 μL af endelige volumen opløsning som beskrevet i tabel over materialer og tabel 1.
Bemærk: Hvis TMRM og den grønne fluorescerende mitokondrie bejdsning skal kombineres med stamcelle markør farvning, derefter erstatte CD150-PE med CD150-PEcy5 og Streptavidin-TX rød med Streptavidin-Pac orange. - Prøverøret opsamles fra centrifugeringen, og supernatanten dekarnerer. Resuspension af pellet i 1 mL antistof blanding. Tilsæt 10 μL celler (fra trin 1,13) i hvert enkelt farve kontrolrør (undtagen Lineage). Tilsæt 10 μL celler (fra trin 1,14) i Lineage enkelt farve røret.
- Stikprøven og de enkeltfarvede kontrol slanger inkuberes ved 4 °C på en shaker i 45 min. dæk isspanden med låg eller aluminiumsfolie.
- Fyld alle rør med buffer og centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c. Supernatanten kasseres, og prøven opslæmmes i 1 mL buffer og enkelt farve kontrol i 200 μL buffer.
- Overfør prøven og enkelt farve kontrollerne til 5 mL filter top FACS rør.
- Tag rørene til sorterings maskinen, og sorter HSC-populationen (gating-strategi i figur 1A) i 1,5 ml-rør, der indeholder 400 μl stamcelle udvidelses medium.
2. ex vivo-kultur af hæmatopoietiske stamceller
- Indsaml rør, der indeholder orterede celler (Se afsnit 1 for celle ekstraktion). Rørene centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c. Fjern forsigtigt det meste af supernatanten uden at skille pellet og Efterlad 50 – 80 μL oven på celle pellet. Dette minimerer celle tabet.
- Resuspension celle pellet i stamcelle ekspansion medium til en endelig volumen afhængig af antallet af betingelser, der skal testes (tælle for 100 μL pr. brønd/tilstand af kultur).
- Forbered et 2x kulturmedium, der indeholder stamcelle ekspansions medium, stamcellefaktor (200 ng/mL), FLT3 ligand (4 ng/mL) og pen-STREP antibiotika (1%) (2x basal medium; Tabel over materialer).
- Tag en steril vævskultur behandlet 96 U-bund brønd plade (tabel over materialer) og identificere brøndene, hvor cellerne vil blive dyrket (plade design i figur 1B).
Bemærk: Brugere rådes til at undgå marginale brønde, da de er mere modtagelige for fordampning. - Put 100 μL af 2x basal medium tidligere forberedt i trin 2,3 i disse brønde. I NR mærket godt tilsættes 2 μL af en 100x NR opløsning (tabel over materialer). Genopfyld NR hver 24 h.
Bemærk: Genopfyldning er specifik for NR. Andre metaboliske modulatorer kan eller ikke kan have brug for genopfyldning. - Frø 100 μL af celler tilberedt i trin 2,2 på toppen af brøndene indeholder 2x basal medium. I dette eksperiment var antallet af HSCs seedede pr. brønd mellem 800 – 1.000 celler.
- Forbered fem ekstra brønde, der indeholder 2x basal medium. I hver af disse tilsættes 100.000 hele knoglemarv celler (fra trin 1,13) resuspenderet i 100 μl af stamcelle ekspansions medium, der skal anvendes som farvning kontrol for post kultur flow flowcytometri analyse.
Bemærk: Hvis brugerne ønsker at kombinere stamcelle markører og mitokondrie markører for post Kulturanalyse anbefales det desuden at sortere progenitorpopulationen (enten ckit + celler eller LKSCD150-celler). Frø disse sorterede progenitorer i farvnings kontrol brøndene for post kultur flow flowcytometri analyse. Forbered en brønd pr. enkelt plet farve. - Sæt 200 μl autoklaveres vand i alle omgivende brønde for at reducere fordampningen fra brønde, der indeholder celler. Pladen skal være uforstyrret i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2 i kultur periodens varighed (72 h). Fjern pladen for at genopfylde NR hver 24 h og Placer den tilbage i inkubator.
3. måling af mitokondriel masse og membran potentiale
- I slutningen af kultur perioden forberede en 100x opløsning af TMRM (20 μM) og Mitotracker grøn (10 μM) (grøn fluorescerende bejdsning) i stamcelle ekspansion medium (tabel over materialer).
- Tilsæt 2 μL 100x TMRM-opløsning og 2 μL 100x grøn fluorescerende bejdsning i hver af test brøndene. Tilsæt 2 μL 100x TMRM i TMRM-kontrol brønden. Tilsæt 2 μL 100x grøn fluorescerende plet i Mitotracker-kontrol brønden. Pladen placeres tilbage i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2 for 45 min. dæk toppen af pladen med aluminiumsfolie.
Bemærk: Der kan fremstilles en ekstra kontrol med verapamil (ABC-pumpe hæmmer), hvis ABC-pumpe medieret farvestof effluks skal testes. Til dette, tilsættes 50 μM verapamil i en af testen brønde 1 h før farvning for TMRM og grøn fluorescerende plet. - Tag pladen ud af inkubatoren, og centrifuger den ved 300 x g i 5 min. Vend pladen om for at fjerne supernatanten. Tilsæt 200 μL standard FACS buffer (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS), centrifuger pladen ved 300 x g i 5 min. Fjern supernatanten. Gentag dette vaske trin 3x. Brugerne skal sikre, at pladen altid er dækket med folie, for at give minimal udsættelse for direkte lys.
Bemærk: Hvis brugerne har brug for at kombinere mitokondrie farvning med stamcelle farvning, skal prøven inkuberet med en antistof blanding af alle stamcelle markører, og enkelt farve kontrollerne skal farves med individuelle antistoffer separat ved 4 °C i 30 – 45 minutter.
Bemærk: På alle trin brugere skal holde pladen dækket med aluminiumsfolie. Brugere skal være opmærksom på, at dette ekstra farvnings trin og de efterfølgende vaske trin kan resultere i yderligere celletab. - Cellerne opslæmmes i 200 μL FACS-buffer og overføres til FACS-rør.
- Kør prøverne på flowcytometer (Se figur 1). Enkelt farve rør indeholdende WBM omfatter: (1) uplettet; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) grøn fluorescerende bejdning (FITC); (5) fuld bejdning (PE og FITC).
- Først erhverve den enkelt-farve kontrol for at indstille maskinen. Brug den kørende software på maskinen til at beregne kompensationen. Når kompensationen er blevet anvendt, skal du anskaffe HSC-prøven og registrere så mange begivenheder som muligt.
Bemærk: Hvis stamcelle-og mitokondrie markører kombineres, skal brugerne være særligt forsigtige med kompensation mellem TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) og SCA-1 (APC). Også, prøverne skal køres umiddelbart efter farvning. - Eksporter FACS-filerne fra flowcytometer, og analysér dataene på en analyse software (tabel over materialer).
- For analysen, åbne filen på analyse software. Ved hjælp af FSC-A og SSC-en gating identificere celle populationen. Identificer undertrøjer i de næste porte, før du afbilde dapi-negative brøk (levende celler). I live Cell Gate lave en kontur plot i TMRM og grøn fluorescerende plet kanal til at måle ΔΨm og masse, henholdsvis (figur 2a). Eksporter den gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) af disse to kanaler i den levende celle port.
- TMRM Low Gate er indstillet baseret på skulder populationen i TMRM kanalen. Den TMRM enkelt-farve kontrol kan bruges til at identificere denne skulder befolkning til at indstille porten. Eksporter andelen af levende af celler i TMRM Low Gate i din kontrol og testprøver til plotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1 viser vi gating-strategien for isolering af hæmatopoietiske stamceller fra musens knoglemarv og pladens layout for deres ex vivo-kultur. Figur 1a viser identifikationen af lymfocyt fraktionen i VSK-A/FSC-a-plottet. Doublets blev fjernet i singlet Gate efterfulgt af identifikation af levende celler ved fravær af DAPI signal. LKS-populationen, defineret af Lineage-Sca1+ckit+, blev identificeret. Denne population er kendt for at indeholde Stam-og progenitorceller. HSCs danner omkring 5 – 10% af cellerne i LKS-populationen og blev identificeret ved gating for CD150+CD48- populationen. Figur 1B repræsenterer opstillingen af 96-brønd pladen til ex vivo-kultur. Sorteret HSCs blev belagt i forskellige kulturforhold: i dette tilfælde, kontrol og NR suppleret kulturforhold. Hele knoglemarvsceller blev også belagt som enkelt farve kontrol som beskrevet i protokollen. Det er vigtigt at fylde alle omgivende brønde med vand for at undgå fordampning af medier fra celle-holdige brønde. Desuden, som tidligere nævnt, Marginal brønde blev undgået for cellekultur, fordi de er mere modtagelige for fordampning.
Figur 2 viser måling af mitokondriel membran potentiale (ΔΨm) og masse i hscs post kultur. Figur 2A viser repræsentative parceller af tmrm niveauer (ovenfor) og grøn fluorescerende mitokondrie bejdsen (nedenfor) i hscs kulturperler i kontrol og nr suppleret betingelser. NR behandling viste en klar stigning i TMRMlav population. Figur 2B viser kvantificeringen fra tre uafhængige prøver. NR-behandling øgede signifikant andelen af celler i TMRMLow Gate og viste en signifikant sænkning af tmrm fluorescens intensitet. Mitokondriel masse (repræsenteret ved grøn-fluorescens intensitet) ikke ændre på NR tilskud. Derudover kombinerede vi stamcelle markør farvning med mitokondrie farvning post kultur. Figur 2C viser gating strategi for at identificere hscs fra LINEAGE negative og LKS populationer post kultur i de to kulturforhold. TMRM og grøn fluorescerende mitokondrielle bejdser profil af disse gated HSCs ses i figur 2D. Eksponeringen for NR viste en signifikant stigning i% TMRMlav population og et signifikant fald i tmrm fluorescens intensitet i gated hscs. Den grønne fluorescerende mitokondrielle bejdset grønne signal forblev uændret i de to betingelser.
Figur 3 viser måling af mitokondriel membran potentiale (ΔΨm) og masse i forskellige humane T-celler: perifert blod mononukleære celler (PBMCs) CD4+ og CD8+ T celler, samt CD4+ og CD8+ tumor infiltrerende LYMFOCYTTER (tils) efter Rapid Expansion Protocol (Rep). Figur 3A viser repræsentative parceller af tmrm niveauer (ovenfor) og grøn-fluorescerende mitokondrielle pletter niveauer (nedenfor) af cirkulerende (PBMC) og tumor-infiltrerende (til) CD4+ og CD8+ T celler. TILs viste en klar stigning i TMRM og grøn fluorescerende mitokondrie plet signal i forhold til cirkulerende T-celler. Figur 3B viser MFI-kvantificeringen af tmrm og grøn fluorescerende mitokondriel farvning. TILs viste højere TMRM og grønne fluorescerende mitokondrielle farvnings signaler sammenlignet med PBMC-afledte T-celler. Disse data indikerer, at TILs har en fornem metabolisk profil med øget ΔΨm og mitokondriel masse.
Figur 1: isolering og kultur af hæmatopoietiske stamceller. a) gating-strategi for isolering af hæmatopoietiske stamceller (hscs) baseret på celleoverflade markører. HSCs blev identificeret som Lineage-Sca1+ ckit+ (LKS) CD150+CD48-. (B) Design af 96 brønd plade sat i kultur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: mitokondrie profiler af hscs. (A) FACS kontur plot,derviser hscs post kultur i basal eller nr suppleret betingelser. TMRM (ovenfor) og grøn fluorescerende mitokondrie bejdspen (Mitotracker) (nedenfor) profiler vises. B) kvantificering af TMRM-og grønt fluorescerende mitokondrie-plet signal. NR tilskud resulterede i et fald i TMRM profil samtidig bevare den grønne fluorescerende mitokondrie plet signal. C) kontur parceller, der viser identifikation af HSC-populationen i kontrol og nr-supplerede betingelser efter kultur. (D) kontur parceller og kvantificering af TMRM og grøn fluorescerende mitokondriel plet signal i fænotypiske hscs post kultur. NR tilskud reduceret TMRM signal mens den grønne fluorescerende mitokondrie plet signal forblev uændret i HSCs. student t test * * *p < 0,001, * * p < 0,01, * p < 0,05, ikke signifikant > 0,05, fejllinjer = SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: mitokondrie profiler af humane pbmcs og tils: (a) FACS KONTUR plot viser CD4+ og CD8+ frisk isoleret fra PBMCS eller tumor-afledte CD4+ og CD8+ post rep (Rapid Expansion Protocol). TMRM (ovenfor) og grøn fluorescerende mitokondrie bejdspen (Mitotracker) (nedenfor) profiler vises. B) kvantificering af TMRM-og grønt fluorescerende mitokondrie-plet signal. TILs viste lavere mitokondrie aktivitet og masse. Student t-test * * *p < 0,001, * *p < 0,01, *p < 0,05, ikke signifikant > 0,05, fejllinjer = SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
| S.No | Navn på antistof | Arbejds fortynding |
| 1 | Streptavidin TX rød | 1/200 |
| 2 | Sca1 APC | 1/200 |
| 3 | Ckit PeCy7 | 1/100 |
| 4 | CD150 PE | 1/100 |
| 5 | CD48 PB | 1/100 |
| Må kun anvendes, hvis stamcelle-og mitokondrie-markører kombineres. | ||
| 6 | Streptavidin Pac orange | 1/200 |
| 7 | CD150 PE-Cy5 | 1/100 |
Tabel 1: antistof fortyndinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En stram regulering af HSC-funktionen er vigtig for at opretholde stabil hæmatopoiese under en organismes levetid. Ligesom forskellige andre celletyper i kroppen, en nøglekomponent, der bidrager til reguleringen af HSC funktion er cellulære metabolisme. Tidligere undersøgelser fra vores Lab9 og andre2,3 har impliceret betydningen af mitokondrier i at opretholde en distinkt metabolisk tilstand i hscs. på grund af det ekstremt lave antal hscs isoleret fra murine knoglemarv, er det vanskeligt at analysere dem via standard metaboliske assays (f. eks iltforbrug med SeaHorse). Baseret på vores tidligere arbejde, vi standardiseret en simpel flow flowcytometri assay til pålideligt måle mitokondrie masse og membran potentiale (en indirekte udmåling for aktivitet) i et lavt antal celler (dvs., hscs). Denne analyse gør det muligt at måle på levende celler uden at kompromittere deres levedygtighed9, hvilket gør dem tilgængelige for eventuelle downstream funktionelle assays (såsom cfus eller knoglemarvstransplantation), som brugerne måtte ønske at udføre. Vi forudser denne analyse er ansat i screening eksperimenter, giver mulighed for en hurtig udlæser på mitokondrie profil af HSCs fra forskellige genetiske baggrunde eller knockout modeller. Det er vigtigt, at vores analyse kan kombineres med cfse-farvning for at have en dobbelt udlæser om HSC-spredning og dens mitokondrie profil9,10, hvilket gør det muligt at analysere den metaboliske skæbne ved at dividere hscs. i betragtning af at det er en vanskelig farvning procedure, og vi arbejder med et lavt antal celler (hscs), er det vigtigt, at efter centrifugering brugerne altid efterlade 80 – 100 μl opløsning i rørene for at minimere celle tabet. Desuden skal rørene eller pladerne under alle indlæg farvnings trin beskyttes mod lys, enten ved at dække dem i folie eller arbejde i et svagt lys miljø. Hvis brugerne beslutter at kombinere HSC Stain med mitokondrie farvestoffer, skal de kontrollere, om kompensationen udføres korrekt, især mellem TMRM (PE), PeCy5 og APC.
Vigtigere, en nylig publikation spørgsmål brugen af mitokondrie farvestoffer i HSCs, fordi de kan være modtagelige for pumpe efflux. Disse undersøgelser rapporterer, at de fleste primitive hæmatopoietiske rum har et højere antal mitokondrier i forhold til deres engagerede forfædre20. I vores erfaring, brugen af mus genetiske modeller (Mito eGFP mus21), mitokondrier farvestof-uafhængige farvningsmetoder (TOM20 antistof), qPCR analyse understøtter forestillingen om, at de fleste primitive hæmatopoietiske rum har lavere mitokondriel indhold10. Vi mener, at der skal foretages yderligere undersøgelser for at afklare denne uoverensstemmelse på området.
Parallelt viser vi, at brugen af mitokondrie profilering kunne udnyttes til at bestemme den metaboliske egnethed af humane TILs og udvikle metaboliske strategier til formål at genoprette funktionen af udmattede T-celler. Faktisk, T-celler isoleret fra PBMCs vise lavere mitokondrie aktivitet (TMRM) og masse (Mitotracker grøn), mens mere udmattede T-celler såsom TILs har højere mitokondrie aktivitet og masse, tyder på en mulig metabolisk omprogrammering opstår under udmattelse. Derfor, tidligere offentliggjorte undersøgelser har vist, at stamcelle-lignende hukommelse T celler (TSCM), T-celler med øget vedholdenhed og i stand til langvarig tilbagekaldelse respons, har lavere ΔΨm og behandlinger målretning T cellemetabolisme kan stærkt påvirke deres funktion22,23.
Endelig mener vi, at vores tilgang kunne være et værdifuldt redskab til identifikation af nye forbindelser, der kan reparere dysfunktionelle HSCs (f. eks, aldring eller hæmatologiske maligniteter) ved at genoprette deres mitokondrie fitness.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nogle elementer i dette arbejde er blevet indsendt som ansøgning P1828EP00 til den europæiske patent myndighed.
Acknowledgments
Vi takker UNIL flow cytometry Core-faciliteten for deres støtte, især Dr. Romain Bedel. Dette arbejde blev støttet af Kristian Gerhard Jebsen Foundation Grant til N. V og O.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Takubo, K., et al. Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).
- Yu, W. M., et al. Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).
- Chen, C., et al. TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species. Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).
- Ito, K., et al. Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).
- Ito, K., et al. Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).
- Tothova, Z., et al. FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress. Cell. 128 (2), 325-339 (2007).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, (2016).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).
- Gratwohl, A., et al. Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis. Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).
- Gooley, T. A., et al. Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Aranda, F., et al. Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy. Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).
- Wherry, E. J.
- Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- van der Waart, A. B., et al. Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy. Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).
- Crompton, J. G., et al. Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics. Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Abe, T., et al. Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).
- Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).
