Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור בvivo הגדלת הרגולטורים של הבטן הרגולציה האינדוקציה תא T. בפרוטוקול זה, תאים דנדריטים מהונדסים מקומית לייצר ריכוזים גבוהים של ויטמין D הפעיל (1, 25-דיהידרוטסטוסטרון ויטמין D או 1, 25 [הו]2ד) ו ויטמין פעיל (חומצה RETINOIC או RA) דה נובו.
Abstract
מחלות מעי דלקתיות (IBD) היא מחלה כרונית דלקתית במערכת העיכול (GUT). בארצות הברית, ישנם כ 1,400,000 מטופלים IBD. מקובל בדרך כלל כי תגובה חיסונית מוסדר לחיידקים המעיים יוזם את המחלה משבש את מכשול האפיתל רירית. אנו מראים לאחרונה כי התאים הרגולציה T (Treg) התקנות הם טיפול מבטיח IBD. בהתאם לכך, מאמר זה מציג פרוטוקול עבור vivo הגדלת הבטן האינדוקציה תא Treg. בפרוטוקול זה, תאים דנדריטים מתוכננים לייצר ריכוזים גבוהים מקומית של שתי מולקולות דה נובו, ויטמין D פעיל (1, 25-דיהידרוטסטוסטרון ויטמין D או 1, 25 [הו]2ד) ו ויטמין פעיל a (חומצה RETINOIC או RA). בחרנו 1, 25 (הו)2d ו RA מבוסס על הממצאים הקודמים מראה כי 1, 25 (הו)2D יכול לגרום את הביטוי של מולקולות רגולטוריות (למשל, forkhead box P3 ו interleukin-10) וכי RA יכול לעורר את הביטוי של קולטני ביות בטן בתאי T. כדי ליצור תאים דנדריטים מהונדסים כגון, אנו משתמשים וקטור לויראלי כדי לשנות את התאים הדנדריטים כדי overexpress שני גנים. גן אחד הוא ציטוכרום P450 משפחה 27 תת B חבר 1 המקודד 25-hydroxyvitamin יטמין D 1α-הידרוקסילאז, אשר מזרז בפיזיולוגית את הסינתזה של 1, 25 (הו)2ד. הגן השני הוא בן משפחה דגנאז 1 A2 אשר מקודד retinאלדהיד דהידרוגנאז 2, אשר מזרז בפיזיולוגית את הסינתזה של RA. פרוטוקול זה יכול לשמש לחקירה עתידית של תאים Treg המעיים בvivo.
Introduction
מחלות מעי דלקתיות (IBD) היא מחלה כרונית דלקתית במערכת העיכול (GUT). בארצות הברית, ישנם כ 1,400,000 מטופלים IBD. זה מקובל בדרך כלל כי תגובה חיסונית מוסדר לחיידק המעיים יוזם את המחלה משבש את מכשול האפיתל רירית1,2. מסיבה זו, מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) הזמין בארה ב מעכב את התפקודים של מגשרים דלקתיים או לחסום את הביות של תאים חיסוניים לתוך הבטן. עם זאת, המגשרים דלקתיים תאים חיסוניים המיועדים גם נחוצים עבור הגנות החיסון. כתוצאה מכך, מעכבי מגשר דלקתית להתפשר ההגנה החיסונית מערכתית ואת חוסמי תא החיסון להחליש את הבטן החיסונית, שניהם יכולים להוביל להשלכות חמורות3,4. בנוסף, המערכת החיסונית חוסמי הביות יכול גם לחסום את הביות של תא T (Treg) תאים לתוך הבטן ומכאן יכול להחמיר את העמידות החיסונית כבר בסיכון בחולים IBD. יתר על כן, חסימת תא Treg מתביית לבטן עלול גם להוביל לדיכוי החיסונית מערכתית בשל הצטברות של תאים Treg בדם5. לבסוף, מעכבי וחוסמי לתפקד באופן מידי, ובכך, דורשים מנהלות תכופים. מינהל תכופים של מעכבי אלה חוסמי יכול עוד להחריף את תופעות לוואי בלתי צפוי.
לאחרונה, הציעו אסטרטגיה הרומן שיכול לרכך או אפילו לחסל את תופעות הלוואי הקשורות התרופות הנוכחיות עבור טיפול IBD6. אסטרטגיה זו מגבירה את האינדוקציה של תאים Treg הבטן ברקמות הלימפה ההיקפית6. הרציונל של אסטרטגיה זו היא כי המעיים מתביית בתאי Treg במיוחד הבית לבטן ולכן לא להתפשר על הגנות החיסונית מערכתית. בנוסף, מאז התאים treg יכול ליצור את הזיכרון7,8, בתאי המעיים treg התאים עלולים לספק שליטה יציבה של דלקת הבטן כרונית בחולים ibd, ובכך, הטיפול לא צריך להיות מנוהל בתדירות גבוהה. יתר על כן, מאז אסטרטגיה זו מגבירה את האינדוקציה של תאים treg המעיים ב vivo, אין לו את הדאגה של vivo אי-יציבות בסביבה proinflammatory מאוד כי הוא קשור העברה המאמצת של תאים מחוץ לבית מיון שנוצר על ידי מבחנה9,10. בהקשר זה, בתאי treg שנוצר מחוץ לתחום הם אחת האסטרטגיות המוצעות לטיפול במחלות אוטואימוניות11,12,13 ו השתלת השתלה14,15. בסופו של דבר, באסטרטגיה זו, תאים דנדריטים (DCs) מתוכננים לייצר ריכוזים גבוהים באופן מקומי של שתי מולקולות דה נובו: ויטמין D פעיל (1, 25-דיהידרוטסטוסטרון ויטמין D או 1, 25 [הו]2ד) ו-ויטמין פעיל (חומצה RETINOIC או RA). בחרנו 1, 25 (הו)2d ו RA כי 1, 25 (הו)2d יכול לגרום לביטוי של מולקולות רגולטוריות (למשל, forkhead box P3 [foxp3] ו interleukin -10 [IL-10])16,17 וכי RA יכול לעורר את הביטוי של קולטני המעיים בתאי T18. בגלל שניהם 1, 25 (הו)2D ו RA יכול גם tolerize dcs28,29, אנחנו מסיבה כי DCs הנדסה יהיה מתוחזק באופן בלתי נשכח במצב tolerize ב vivo ולכן לעקוף את החששות vivo אי-יציבות הקשורים בקרי מבחנה המופק בתחום ה-dc (toldcs)19,20,21. במובן זה, toldcs הם גם אחת האסטרטגיות המוצעות עבור ב vivo הגדלת של פונקציות תא treg19,20,21. כדי לתמוך ההיגיון שלנו, הראינו כי DCs הנדסה, על vivo משלוח, יכול להגדיל את אינדוקציה של בתאי המעיים Treg ברקמות הלימפה ההיקפית6.
יתרון נוסף של האסטרטגיה המוצעת שלנו היא כי 1, 25 (הו)2D יש גם פונקציות אחרות שעלולות להועיל לחולים ibd. אלה פונקציות אחרות כוללות את היכולת של 1, 25 (הו)2ד כדי לעורר את הפרשת antimicrobials22 וכדי לדכא קרצינובגנזה23. זיהומים וסרטן משויכים לעתים קרובות עם ibd24,25.
כדי ליצור את DCs שיכולים לייצר ריכוזים גבוהים באופן מקומי של שניהם 1, 25 (הו)2D ו RA דה נובו, אנו משתמשים וקטור לויראלי כדי להנדס DCs כדי לבטא שני גנים. גן אחד הוא ציטוכרום P450 משפחה 27 תת B חבר 1 (CYP27B1) המקודד 25-הידרוקסיל ויטמין D 1α-הידרוקסילאז (1α-הידרוקסילז), אשר מזרז פיזיולוגית את הסינתזה של 1, 25 (הו)2ד. הגן השני הוא האלדהיד דהידרוגנאז 1 בן משפחה A2 (ALDH1a2) המקודד retinאלדהיד דהידרוגנאז 2 (RALDH2), אשר מזרז בפיזיולוגית את הסינתזה של RA6.
בגלל שvivo הגדלת האינדוקציה של תא Treg בעלי המעיים הוא פוטנציאל חשוב לטיפול IBD, בפרוטוקול הבא אנו פירוט את ההליכים לדור של 1α-הידרוקסילז-RALDH2-הבעת בקרי מחשבים (DC-CYP-בתאי ALDH) כי יכולה לשמש לחקירה עתידית של תאי טרג בעלי מעיים בvivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל בvivo בעלי חיים פרוטוקולים למחקר נבדקו ואושרו על ידי מוסדי לומה בעלי חיים מוסדיים הוועדה והשימוש ועדת (iacuc), כמו גם טיפול בעלי חיים ולהשתמש במשרד סקירה (acuro) של צבא ארה ב המחקר הרפואי מחקר הפיקוד (usamrmc) של ה . משרד ההגנה
1. הכנת הנגיף המבטא הן 1 α-הידרוקסילז ו RALDH2 (לנטי-CYP וירוס)
- יום 0: בשעות הבוקר המוקדמות, להכין 5 x 105 תאים/mL של תאים 293t ב-CM-10-D מדיום תרבות התא.
- זרעים 20 מ ל/צלחת ב 150 מ"מ x 25 מ"מ מנות תרבות. תרבות התאים ב 37 ° c ו 5% CO2 עבור 24 כ ' שטף יגיע ~ 80-90% לאחר 24 שעות.
- יום 1: להפוך את HBS 2x (50 מ"מ HEPES, 280 מ"מ הנאל, ו 1.5 mM Na2hbs4, pH 7.1). מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c.
- להפוך 2 מ ' קאl2 ו לאחסן בטמפרטורת החדר.
- על כל 150 mm x 25 מ"מ מאכל התרבות, להכין תערובת DNA משקעים בצינור התרבות 50 mL סטרילי. ראשון, להוסיף 1,620 μL של 2x HBS, 9.5 μg של PMD2G (VSVG), 17.5 μg של pCMVR 8.74 (Capsid), 27 μg של Lenti-CYP-ALDH-באמצע (וקטור לנטינגיי הנושאת הן CYP27B1 ו ALDH1a2). שנית, להוסיף H2O כדי נפח הסופי של 3,037.5 μl.
- בשלב האחרון, להוסיף 202.5 μL של 2 M CaCl2 dropwise תוך ערבוב את הפתרון לריכוזים הסופי של hbs 1x ו 125 MM cacl2. האפשרות CaCl2 חייבת להיות האחרונה שתתווסף. השאירו את תערובות הגלגול בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עם ערבוב מדי פעם. עבור מספר רב של 150 מ"מ x 25 מ"מ מנות תרבות, לשנות את הגודל בהתאם.
- הוסף את 3,240 μL של ה-DNA המשקעים תערובת dropwise כדי 1 150 מ"מ x 25 מ"מ התרבות המכילה את התאים 293T. מערבולת בעדינות את קערת התרבות מצד לצד תוך הוספת תערובת ה-DNA משקעים. מודחת הצלחת ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 24 שעות.
- יום 2: להסיר את הפתרון של הסידן פוספט, לשטוף בעדינות עם ה-PBS 1x, ולהאכיל מחדש את תרבות התאים עם מדיום תרבות התא ס"מ-4-D. מודאת התאים ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 24 שעות.
- יום 3: בציר הסופרנטנים בבקבוקי אחסון סטרילי ובחנות ב-4 עד 8 ° c. מלאו את תרבות התא עם מדיום תרבות התאים בגודל CM-4-D. תרבות התאים ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור עוד 24 h.
- יום 4: בציר הסופרנטנים לתוך בקבוקי אחסון סטריליים. סנן את הסופרנטטים מיום 3 והיום 4 באמצעות מסנן 0.45 יקרומטר. כדי לרכז את הנגיף המדומה VSVG, להעביר את הסופרנטנים לתוך צינורות צנטריפוגה ו ספין ב 4,780 x g עבור 24 h ב 4 ° c.
- יום 5: שופכים את הסופרנטנים את כדורי (הגלולה היא לעתים קרובות גלוי) ולאפשר צינורות לנקז על מגבת נייר בארון סטרילי בטיחות במשך כמה דקות.
- מחדש את כדורי על ידי ליטוף עם ה-PBS סטרילי המכיל 5% גליצרול. נפח עבור השעיה מחדש יהיה 33.3 μL לכל 150 mm x 25 מ"מ צלחת התרבות.
- Aliquot 200 μL/שפופרת ולאחסן ב-80 ° c. הפוך סדרת מחלקים נפרד של 50 μl/בקבוקון למטרות טיטור. הטיטרס צריך להיות בטווח של 108– 109 התמרה יחידות (TUs)/ml.
- להוסיף אקונומיקה לתוך מנות התרבות ולהשליך אותם.
הערה: תאים אלה מזוהמים הם הדאגה הגדולה ביותר בטיחות בפרוטוקול מאז כל האלמנטים לויראליות מבוטא בתאים.
2. יצירת מח עצם בקרי תחום נגזר (BMDCs)
- בציר הקציר והפמורי מ 4-5 עכברים Balb/c לתוך שפופרת פוליפרופילן סטרילית 50 mL המכילה את התרבות בינונית6.
- העבר את הטטיה והפמורס לתוך מאכל תרבות בגודל 20 מ מ של 100 מ"מ המכיל את מדיום התרבות. הסרת רקמות כגון שרירי הטיטיה והפמורי בעזרת מספריים מבתר ומלקחיים.
- חותכים את שני הקצוות של הטיטיה ואת הפטיורים כדי לחשוף את חלל מח העצם.
- לצייר 10 מ"ל בינוני בתרבות במזרק 10 מ ל המצורפת ל 30 גרם מחט.
- בזהירות להכניס את המחט לתוך חלל מח העצם ולשטוף את מח העצם לתוך נקי 50 mL סטרילי צינור פוליפרופילן. חזור על הליך זה במידת הצורך, כדי להבטיח כי מח העצם התרוקן לחלוטין.
- גלולה את התאים מח העצם על ידי צנטריפוגה (400 x g) ב 2 – 8 ° צ' עבור 5 דקות.. מרוב העניין
- השהה מחדש את הגלולה עם 5 מ ל של 1 x מאגר פירוק של תא דם אדום.
- דגירה את התאים בטמפרטורת החדר עבור 4 – 5 דקות עם רעד מדי פעם.
- להפסיק את התגובה על ידי הוספת 30 מ ל של מדיום התרבות.
- גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה (400 x g) ב 2 – 8 ° צ' עבור 5 דקות. להשעות את התאים ב 10 מ ל של מדיום בינונית-10-R התרבות התא. במידת הצורך, ניתן להעביר את התאים דרך מסננת תא 40 יקרומטר כדי להסיר פסולת.
- בצע ספירת תאים והתאם את התאים ל-1 x 106 תאים/mL באמצעות מדיום של תרבות תא ס"מ-10-R.
- הוסף רקומביננטי murine גרנולוציט/מקרופאג גורם ממריץ מושבה (GM-שדרתי, ריכוז סופי = 100 U/mL) ו מורלין interleukin-4 (IL-4, הריכוז הסופי = 10 U/mL).
הערה: פתרונות המניה של GM-שדרתי ו-IL-4 מאוחסנים ב-80 ° c ב 100,000 U/mL (1, 000x) ו 10,000 U/mL (1, 000x), בהתאמה. - הפץ את התאים לתוך 6 לוחות התרבות ב 4 מ ל/ובכן תרבות התאים ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 48 h.
- הסר תאים שאינם מחסיד עם ליטוף עדין.
- הוספת מדיום תרבות תא CM-10-R המכיל את ה-GM-שדרתי (100 U/mL) ו-IL-4 (10 U/mL). תרבות התאים עבור עוד 48 h.
- הקציר תאים לא מחסיד (BMDCs) עבור התמרה על ידי וירוס lenti-CYP-ALDH.
3. התמרה של בקרי קבוצת מחשבים עם lenti-CYP-ALDH וירוס כדי ליצור DC-CYP-ALDH תאים
- להכין 1 x 106 DCs/גם בנפח כולל של 0.5 ML של CM-10-R מדיום תרבות התא המכיל 50 μl של וירוס 8 μg/mL protamine ב 6 היטב לוחית התרבות.
- תרבות התאים ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 24 שעות.
- החליפו את המדיום בתווך ובתרבית של תרבות התאים בגודל CM-10-R ובכל הגוף, ב37 ° c ו-5%2 בעוד 24 שעות. בשלב זה, ניתן להעריך את הפעילויות האנזימטיות של 1α-הידרוקסילאז ו-RALDH2 (ראה שלב 4). אם יש צורך, חזור על שלבים 3.1 – 3.3 עבור התמרה שנייה.
- הוסף ליפופוליסכריד (100 ng/mL) והתרבות התאים עבור 24 שעות.
- המסיק תאים (DC-CYP-ALDH תאים) עבור ניסויים.
4. הערכת ביטוי היתר-הידרוקסילאז וRALDH2 בDC-CYP-בתאי אלנד
- הערכה של הבעות היתר-הידרוקסילאז בתוך DC-CYP-התאים
- זרעים 1.0 x 106 DC-CYP-aldh תאים/גם ב 2 מ"ל של CM-10-R התרבות תאים בינונית לתוך 12 לוחיות התרבות היטב.
- הוסף 25 (הו) D לריכוז הסופי של 2.5 μM. מודזלת את תאי הבירה-CYP-ALDH במשך 24 שעות.
- לקצור את הסופרנטנים ולחנות ב-20 ° c.
- שיטת 1, 25 (או)2ריכוזי תלת-ממד באמצעות שיטת הרדיוחיסוני הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
- לקבוע את הביטוי של 1α-הידרוקסילאז ב-DC-CYP-ALDH תאים על ידי מיון תא המופעל על ידי הזריחה (FACS) באמצעות נוגדן anti-CYP27B1.
- הערכת הRALDH2 המבוטאת ב-DC-CYP-בתאי-ALDH
הערה: הביטוי והפעילות של הRALDH2 היתר נקבעים באמצעות ערכת זיהוי אלדהיד המסחרית (ראה טבלת חומרים).- זרע 1 מ ל של DC-CYP-ALDH או תאי בקרה (1 x 105 תאים/mL במאגר הקבוע) בכל אחד מ-2 צינורות mL (אחד המסומן כ-"control" והשני המסומן כ-"Test").
- הוסף 10 μL של התמיסה (DEAB) פתרון (1.5 mM ב 95% אתנול) לכל אחד מצינורות הבקרה ולערבב מיד. DEAB הוא מדכא RALDH2.
- הוסף 5 μL של המצע הקרינה הפלואורסצנטית RALDH הופעלה (300 μM) לבקרה ולבדוק צינורות ולערבב מיד.
- דגירה את הצינורות עבור 45 דקות.
- גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 400 x g ב 2 – 8 ° צ' עבור 5 דקות.. מרוב הסופר
- מרכיבים מחדש את התאים ב-200 μL של מאגר התשאיפה.
- לשמור על התאים על הקרח ולהמשיך לניתוח על ידי FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DC-CYP-ALDH תאים הביעו כמות משמעותית של 1α-הידרוקסילאז. כדי לקבוע אם התאים של DC-CYP-ALDH שנוצרו מ-BMDCs הביעו כמות גדולה באופן משמעותי של 1α-הידרוקסילז, BMDCs הותמרה עם וירוס lenti-CYP-ALDH כדי לייצר מעבד מח עצם-CYP-בתאי הספק (BMDCS-CYP). לאחר מכן נבדקו התאים BMDC-CYP-ALDH לביטוי של 1α-הידרוקסילז על ידי FACS. הנתונים שלנו הראו כי התאים BMDC-CYP-ALDH, בהשוואה ל-Bmdc של ההורים, מוצג ביטוי משופר של 1α-הידרוקסילז (איור 1א). קבענו גם את הפעילות האנזימטית של 1α-הידרוקסילאז בתאי ה-BMDC-CYP-ALDH. כדי לעשות זאת, 1.0 x 106 BMDC-CYP-aldh תאים ב 2 מ מ של מדיום תרבות תא CM-10-R נוספו 12 לוחיות התרבות היטב. 25 (הו) D התווסף לאחר מכן לתרבות התא בריכוז הסופי של 2.5 μM. התאים היו מתורבתים ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 24 שעות והסופרנטנים נקצרו למדידה של 1, 25 (או)2ד באמצעות שיטת הרדיוחיסוני (RIA). הנתונים שלנו הראו כי 1, 25 (או)2בריכוזים של התרבות הסופר של התאים BMDC-cyp (bmdc התמרה עם LENTI-CYP-gfp וירוס) ו-bmdc-התאים cyp-aldh היו כל אחד בערך 20x גבוה יותר מאלה של bmdc הורים והתאים bmdc-Aldh (bmdc עם וירוס lenti-aldh) (איור 1B).
DC-CYP-ALDH תאים הביעו כמות משמעותית של RALDH2. כדי לקבוע אם התאים BMDC-CYP-ALDH הביעו כמות משמעותית באופן משמעותי של RALDH2, מצע RALDH2 התווסף לתרביות תאים בנוכחות או היעדרות של מעכבי RALDH2 diethy (DEAB) (15 μM). מוצר הפלורסנט שנשמר בתוך התאים נותח על ידי FACS. הנתונים שלנו הראו כי משמעות הכוונות זריחה (MFIs) של התאים BMDC-CYP-ALDH היו כ 6x גבוה יותר מאשר אלה של Bmdc הורים, הרומז כי התאים BMDC-CYP-ALDH, כאשר לעומת Bmdc הורים, הביע משופרתבאופן משמעותי RALDH2 אנזימטיתהפעילות(איור
DC-CYP-בתאי ALDH מגבירה את אינדוקציה של foxp3+CCR9+ בטן מתביית תאים בתחום החוץ. כדי לחקור אם DC-cyp-aldh התאים הצליחו להגדיל את האינדוקציה של תאים treg בטן בעלי מבחנה בחוץ, אנו התמרה DC 2.4 תאים (מח עצם נגזר-קו DC26,27,28,29), עם lenti-cyp-aldh וירוס שנוצר DC 2.4-cyp-aldh תאים. לאחר מכן, קבענו אם התאים DC 2.4-CYP-ALDH היו מסוגלים להגדיל את האינדוקציה של תאי הבטן Treg בתוך מבחנה. בהתאם, תאים CD4+ T נאיבי היו מטוהרים מ C57BL/6 עכברים. מטוהר CD4+ T תאים מטוהרים ב 5 x 105 תאים/טוב היו אז באופן מתורבת עם הורים dc 2.4 תאים (1 x 105 תאים/ובכן) או DC 2.4-cyp-aldh תאים (1 x 105 תאים/ובכן) ב 24 לוחיות התרבות במדיום ללא סרום בנוכחות של נוגדן מונוCD3 אנטי-שבטיים (5 μg/ml) ו רקומביננטי האדם IL-2 (50 U/ml). בנוסף, 25 (הו) D ו רטינול בריכוזים שונים נוספו גם לתוך התרבויות. התאים היו מודבטים ב 37 ° צ' ו 5% CO2. חמישה ימים לאחר מכן, התאים נותחו על ידי FACS עבור הביטויים של foxp3 ו c-c כימוקין סוג קולטן 9 (CCR9). הנתונים שלנו הראו כי בנוכחות של מצעים, התאים של DC 2.4 לא לשנות באופן משמעותי את השפע של foxp3+CCR9+ תאים באוכלוסיות CD4+ T (איור 3A, B). לעומת זאת, התאים של DC 2.4-CYP-ALDH הגדילו באופן משמעותי את השפע של foxp3+CCR9+ תאים בין CD4+ T תאים. בנוסף, יותר 25 (הו) D הוסיף, ככל היכולת של התאים DC 2.4-CYP-ALDH להגדיל את השפע של foxp3+CCR9+ תאים בין CD4+ T תאים. לכן, הנתונים שלנו תומכים כי התאים DC-CYP-ALDH יכול להגדיל את האינדוקציה של תאים Treg המעיים בתוך מבחנה.
התאים הDC-CYP-ALDH מגבירה את האינדוקציה של foxp3+CCR9+ בטן בתאי המעיים ב vivo. כדי לקבוע אם התאים של DC-CYP-ALDH יוכלו להגדיל את האינדוקציה של תאי הבטן בvivo, אנו intraperitoneally את אחד התאים הבאים לתוך עכברים Balb/c: DC הורים 2.4 תאים, DC 2.4-CYP תאים (DC 2.4 תאים התמרה עם lenti-CYP-GFP וירוס), ואת DC-2.4-CYP-ALDH תאים. ארבעה ימים לאחר הממשל התא, בלוטות הלימפה מצע נבדקו על ידי facs (איור 4א). הנתונים שלנו הראו כי התאים DC 2.4-CYP-ALDH, בהשוואה לפקדים, הגדיל באופן משמעותי את השפע של foxp3+CCR9+ תאים בין CD3+ T תאים (איור 4B, C). בהתבסס על תוצאות אלה, אנו מסיקים כי הממשל תא DC-CYP-ALDH מגביר באופן משמעותי את אינדוקציה של foxp3+CCR9+ T תאים ברקמות הלימפה ההיקפית.
איור 1: DC-CYP-בתאי ALDH הביעו כמות גדולה באופן משמעותי של 1α-הידרוקסילאז. (א) BMDC-CYP-aldh התאים נוצרו ונותחו על ידי facs. מזימה מייצגת של FACS מציגה את הביטוי של 1α-הידרוקסילאז ב-BMDCs של ההורים והתאים BMDCS-CYP-ALDH (מגודרת בתאים חיים). (ב) 1α-המצע הידרוקסילאז (כלומר, 25 (או) D) התווסף לתרביות DC. 24 שעות מאוחר יותר, הסופרנטנים נאספו ו 1, 25 (הו)שניריכוזי D נמדדו. ריכוזי הנתונים של 1, 25 (או)2D בתרבויות ה-bmdcs של ההורים, התאים BMDCS-cyp, תאים BMDCS-aldh, ותאי BMDCS-CYP-aldh. * * p < 0.01. מבחן אנובה. n = 4. דמות זו מותאמת משו ואח '6. זכויות יוצרים 2019. האיגוד האמריקאי של האימונוולוג, Inc. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: DC-CYP-בתאי ALDH הביעו כמות משמעותית של RALDH2. (א) BMDC-CYP-aldh התאים נוצרו ונותחו כמתואר בפרוטוקול. מגרשים בשכבות מייצגים להציג את הבודיפיה של עמינח בעלי הקרינה הפלואורסצנטית ב-BMDCs ו-BMDCS-CYP-ALDH בנוכחות (+ DEAB) או היעדרות (-DEAB) של RALHD2 מעכב diethyenzאלדהיד (DEAB). (ב) מתכוון לעוצמות הקרינה הפלואורסצנטית (mfis) של בודיפיה עמינח ב-bmdcs ובתאי ה-BMDCS-CYP-aldh בהעדר deab. * p < 0.05; מבחן t; n = 4. דמות זו מותאמת משו ואח '6. זכויות יוצרים 2019. האיגוד האמריקאי של האימונוולוג, Inc. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: DC-CYP-בתאי ALDH מוגבר האינדוקציה של foxp3+CCR9+ בטן מתביית תאים בתחום החוץ. (A) CD4+ תאי T תמימים היו מבודדים מ C57BL/6 העכבר ה,שליטת. התאים CD4+ T הופעלו לאחר מכן בתרבויות על ידי ANTI-CD3 mab (5 μg/mL) בנוכחות או הורים dc 2.4 תאים או dc 2.4-CYP-aldh תאים. בנוסף, התרבויות נוספו עם הריכוזים המצוין של 25 (הו) D ו רטינול. חמישה ימים לאחר מכן, התאים נאספו ונותחו על ידי FACS עבור הביטויים של foxp3 ו CCR9 בCD3+CD4+ T האוכלוסייה תאים. מגרשים מייצגים של FACS מציגים את הביטויים של foxp3 ו-CCR9 באוכלוסיית התאים CD3+CD4+ T. (ב) נתונים מצטברים מ-(א). * p < 0.05; מבחן ANOVA; n = 4. דמות זו מותאמת משו ואח '6. זכויות יוצרים 2019. האיגוד האמריקאי של האימונוולוג, Inc. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: DC-CYP-בתאי ALDH מוגבר האינדוקציה של foxp3+CCR9+ בטן מתביית תאים treg ב vivo. (א) balb/c עכברים intraperitoneally (כש) קיבל אחד העברות DC הבאים (העברה): אין העברה Dc (אין העברה), dc הורים 2.4 תאים, dc 2.4-cyp תאים, ו dc 2.4-CYP-aldh תאים. ארבעה ימים לאחר מכן, בלוטות הלימפה מצע (mlns) נותחו על ידי facs. (ב) מגרשים של facs הנציג מציגים את הביטויים של foxp3 ו-CCR9 באוכלוסיית CD3+ T. (ג) נתונים מצטברים מ (ב) מציגים את האחוז של foxp3+CCR9+ תאים באוכלוסיית CD3+ T. תאים היו מגודרת על CD3+ T תאים עבור כל הניתוחים. במידת הצורך, הנתונים המוצגים הם ± SEM. * p < 0.05; מבחן ANOVA; n = 4 – 6. דמות זו מותאמת משו ואח '6. זכויות יוצרים 2019. האיגוד האמריקאי של האימונוולוג, Inc. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה אנו מתארים את השימוש DC-CYP-ALDH התאים, לצורך הגדלת אינדוקציה של תאים Treg הבטן מתביית ברקמות הלימפה היקפית. הנתונים שלנו הראו כי התאים DC-CYP-ALDH יכול לסנתז ריכוזים גבוהים באופן מקומי של דה נובו של שניהם 1, 25 (הו)2D ו-RA בתחום הנוכחות של מצעים המקביל (כלומר, 25 [הו] D ו רטינול, בהתאמה). בגלל ריכוזי דם מספיקים של 25 (הו) D ו רטינול ניתן להשיג בקלות באמצעות ויטמין D ו supplementations בהתאמה בחולים שיש להם ליקויים30,31, אנחנו הסיבה לכך DC-cyp-aldh תאים יכול להגדיל את האינדוקציה של תאים treg הבטן היקפית רקמות הלימפה כאשר ריכוז דם נורמלי של 25 (הו) D ו רטינול כדי לתמוך ההיגיון הזה, הנתונים שלנו מדגים כי בחיות בריאים נורמלי כי אין ויטמין D וויטמין A ליקויים, התאים DC-CYP-ALDH להגדיל את האינדוקציה של תאים Treg המבטאים הן מולקולות רגולטוריות (כלומר, foxp3 ו-IL-10) ו קולטן ביות בטן (כלומר, CCR9). לכן, ניתן להשתמש בטכנולוגיה זו לחקירה נוספת של תאי Treg בעלי מעיים לטיפול ב-IBD.
צעד קריטי אחד בפרוטוקול זה הוא הפקת נגיף lenti-CYP-ALDH עם מוצרי האצה גבוהים. הנגיף המועדף צריך להיות 108– 10 ו-9 TUs/mL. סיכוייו גבוהה של וירוס lenti-cyp-aldh הכרחי עבור יעילות התמרה גבוהה ב-DCs.
שלב קריטי נוסף של פרוטוקול זה הוא היעילות של התמרה ב-DCs. מכיוון DC-CYP-ALDH תאים לא להיות בלתי מתורבת בטכנולוגיה זו, זה חיוני כי שיעור התמרה להיות יותר מ 90% כדי להבטיח כי תאים DC-CYP-ALDH יכול ביעילות להגדיל את אינדוקציה של תאי המעיים הבטן Treg ב vivo. בנוסף, התאים DC-CYP-ALDH יכולים להיות מטוהרים עוד יותר על ידי FACS לפני בvivo המינהל32.
יתרון ייחודי של פרוטוקול זה הוא כי התאים DC-CYP-ALDH לא צריך להיות בלתי מתורבת לפני במינהל vivo. הוא צפוי כי התאים DC-cyp-aldh, כתוצאה של פעולות משולבות של 1, 25 (הו)2D ו-RA, יישמרו במצב tolerogenic ב vivo כי הן 1, 25 (הו)2ד ו RA הוכחו tolerogenic DCs33,34. לכן, אנו מצפים כי התאים DC-CYP-ALDH לא יהיו חששות אי-יציבות בסביבה vivo proinflammatory.
כיום, יש לנו רק הוכיחו כי התאים DC-CYP-ALDH יכול להגדיל את התדר (מספר) של תאי המעיים Treg הבקר ברקמות הלימפה ההיקפית והמעיים6. כתוצאה מכך, התפקוד הרגולטורי במעיים כמכלול משופר כיוון שאחוז התאים הטרג במעיים מוגבר. איור 4 מראה כי בהשוואה לאלה עם טיפולי שליטה, טיפול תוך הצפק עם התאים DC-cyp-aldh הגדילו באופן משמעותי את אחוז CCR9+foxp3+ treg תאים בבלוטות הלימפה מצע, כלומר, יותר תאים treg בבלוטות לימפה מצע מסוגלים במיוחד הביתה לתוך רקמות המעיים. איור 4 עוד מראה כי ביותר foxp3+ T תאים בבלוטות הלימפה מצע הם שליליים עבור CCR9 ולכן אין להם יכולת ביות בטן. עם זאת, אם תאים DC-CYP-ALDH יכולים גם לשפר את התפקוד הרגולטורי של כל תא Treg כשלעצמו (כגון רמות ביטוי משופרות של foxp3 ו/או IL-10) דורש חקירה נוספת.
הריאגנטים והחומרים המתוארים כאן הם ללימודי בעלי חיים בלבד. עם זאת, הפרוטוקול הוא ישים עבור מחקרים אנושיים באמצעות ריאגנטים וחומרים האדם המקביל, למעט כי בקרי Dc ייווצר מן הדם ההיקפית מונוציטים בבני אדם. המטרה האולטימטיבית של פרוטוקול זה היא הדור של התאים הקליניים DC-CYP-ALDH לטיפול של IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ד"ר שיאוולאני טאנג ודיויד ג'יי ביילינק הם ממציאים של פטנט ממתין הקשור למחקר זה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי המשרד של עוזר מזכיר ההגנה לענייני בריאות באמצעות עמית ביקורת המחקר הרפואי התוכנית תחת הפרס לא. W81XWH-15-1-0240 (XT). דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן אלה של המחבר והן לא בהכרח אושרו על-ידי משרד הביטחון. עבודה זו הייתה גם נתמכת באופן חלקי על ידי מלגות חדשנות מחקר מהמחלקה לרפואה באוניברסיטת לומה לינדה (681207-2967 [XT ו-GG], 681205-2967 [XT], ו 325491 [DJB]).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
References
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).
- Clifford, D. B., et al. Natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy in patients with multiple sclerosis: lessons from 28 cases. Lancet Neurology. 9 (4), 438-446 (2010).
- Linda, H., et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy after natalizumab monotherapy. New England Journal of Medicine. 361 (11), 1081-1087 (2009).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Xu, Y., et al. In Vivo Generation of Gut-Homing Regulatory T Cells for the Suppression of Colitis. Journal of Immunology. 202 (12), 3447-3457 (2019).
- Rosenblum, M. D., Way, S. S., Abbas, A. K.
- Grimm, A. J., Kontos, S., Diaceri, G., Quaglia-Thermes, X., Hubbell, J. A. Memory of tolerance and induction of regulatory T cells by erythrocyte-targeted antigens. Science Report. 5, 15907 (2015).
- Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
- Bhela, S., et al. The Plasticity and Stability of Regulatory T Cells during Viral-Induced Inflammatory Lesions. Journal of Immunology. 199 (4), 1342-1352 (2017).
- Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), (2015).
- Marek-Trzonkowska, N., et al. Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets - results of one year follow-up. Clinical Immunology. 153 (1), 23-30 (2014).
- Desreumaux, P., et al. Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn's disease. Gastroenterology. 143 (5), 1201-1202 (2012).
- Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117 (14), 3921-3928 (2011).
- Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
- Kang, S. W., et al. 1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region. Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).
- Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis. Brain. 132, Pt 5 1146-1160 (2009).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. M. TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses. Immunology Letters. 125 (2), 114-118 (2009).
- Danova, K., et al. NF-kappaB, p38 MAPK, ERK1/2, mTOR, STAT3 and increased glycolysis regulate stability of paricalcitol/dexamethasone-generated tolerogenic dendritic cells in the inflammatory environment. Oncotarget. 6 (16), 14123-14138 (2015).
- Liu, P. T., et al. Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response. Science. 311 (5768), 1770-1773 (2006).
- Cao, H., et al. Application of vitamin D and vitamin D analogs in acute myelogenous leukemia. Experimental Hematology. 50, 1-12 (2017).
- Anderson, A., et al. Lasting Impact of Clostridium difficile Infection in Inflammatory Bowel Disease: A Propensity Score Matched Analysis. Inflammatory Bowel Disease. 23 (12), 2180-2188 (2017).
- Tsai, J. H., et al. Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).
- Lee, H. W., et al. Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes. Science Reports. 5, 9865 (2015).
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Okada, N., et al. Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens. British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).
- Li, C. H., et al. Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis. FASEB J. , (2017).
- Narula, N., et al. Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn's Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study. Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).
- Ahmad, S. M., et al. Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy. Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).
- Noronha, S. M. R., et al. Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin. Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).
- Ferreira, G. B., et al. Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways. Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).
- Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells. Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).
