توليد المناظر الطبيعية الكيميائية الديناميكية الخاضعة للرقابة لدراسة السلوك الميكروبي
Summary
يتم تقديم بروتوكول لتوليد المناظر الطبيعية الكيميائية الديناميكية عن طريق الانحلال الضوئي داخل الاجهزة microfluidic وmillifluidic. هذه المنهجية مناسبة لدراسة العمليات البيولوجية المتنوعة ، بما في ذلك السلوك المتنوعة ، وامتصاص المغذيات ، أو التكيف مع المواد الكيميائية للكائنات الحية الدقيقة ، سواء على مستوى الخلية الواحدة أو السكان.
Abstract
نحن نُظهر طريقة لتوليد نبضات كيميائية ديناميكية خاضعة للرقابة – حيث يصبح attractant المترجم متاحًا فجأة على النطاق الصغير – لإنشاء بيئات صغيرة لتجارب chemotaxis الميكروبية. لإنشاء نبضات كيميائية ، قمنا بتطوير نظام لإدخال مصادر الأحماض الأمينية على الفور عن طريق التحليل الضوئي للأحماض الأمينية في قفص داخل غرفة microfluidic polydimethylsiloxane (PDMS) التي تحتوي على تعليق بكتيري. طبقنا هذه الطريقة على البكتيريا الكيميائية ، Vibrio ordalii، والتي يمكن أن تتسلق بنشاط هذه التدرجات الكيميائية الديناميكية في حين يتم تعقبها عن طريق المجهر الفيديو. الأحماض الأمينية، التي قدمت خاملة بيولوجيا (‘caged’) عن طريق التعديل الكيميائي مع مجموعة حماية قابلة للإزالة الضوئية، موجودة بشكل موحد في التعليق ولكنها غير متوفرة للاستهلاك حتى إطلاقها المفاجئ، والذي يحدث في النقاط التي يحددها المستخدم في الزمان والمكان عن طريق شعاع LED مركز بالقرب من الأشعة فوق البنفسجية A. يمكن تحديد عدد الجزيئات التي يتم إطلاقها في النبض من خلال علاقة معايرة بين وقت التعرض وكسر الكسر الغير مُقَدَّم، حيث يتميز طيف الامتصاص بعد التحليل الضوئي باستخدام التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية. يمكن دمج غشاء البولي المسامية النانوية (PCTE) في الجهاز الميكروسائلي للسماح بالإزالة المستمرة عن طريق تدفق المركبات غير المستقرة والوسائط المستهلكة. يتم تحقيق رابطة قوية لا رجعة فيها بين غشاء PCTE وبنية PDMS microfluidic عن طريق طلاء الغشاء مع محلول من 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) تليها تنشيط البلازما من الأسطح التي يتعين استعبادها. ويمكن للنظام الذي يتم التحكم فيه بالحاسوب أن يولد تسلسلات من النبضات يحددها المستخدم في مواقع مختلفة وبكثافة مختلفة، وذلك لخلق مناظر طبيعية للموارد ذات تغير مكاني وزمني مقرر. وفي كل مشهد كيميائي، يمكن الحصول على ديناميات الحركة البكتيرية على النطاق الفردي وتراكمها على مستوى السكان، مما يسمح بالقياس الكمي لأداء التكتيك الكيميائي وآثاره على التجمعات البكتيرية في البيئات ذات الصلة إيكولوجيا.
Introduction
تعتمد الميكروبات على chemotaxis ، وعملية الكشف عن التدرجات الكيميائية وتعديل الحركة في الاستجابة1، للتنقل في المناظر الطبيعية الكيميائية ، والاقتراب من مصادر المغذيات والمضيفين ، والهروب من المواد الضارة. هذه العمليات على نطاق صغير تحديد الحركية على نطاق كلي من التفاعلات بين الميكروبات وبيئتها2،3. وقد أحدثت التطورات الأخيرة في microfluidics وتقنيات microfabrication ، بما في ذلك الطباعة الحجرية لينة4، ثورة في قدرتنا على خلق البيئات الدقيقة التي تسيطر عليها لدراسة التفاعلات من الميكروبات. على سبيل المثال ، درست التجارب السابقة chemotaxis البكتيرية عن طريق توليد درجة عالية من التحكم ، وتدرجات مستقرة من تركيزات المغذيات المتوسطة إلى العالية5،6. ومع ذلك ، في البيئات الطبيعية ، يمكن أن تكون التدرجات الكيميائية على نطاق صغير قصيرة الأجل – تبدد عن طريق الانتشار الجزيئي – وظروف الخلفية غالبا ما تكون مخففة للغاية7. لقياس الاستجابة الكيميائية للمجموعات الميكروبية التي تعرضت لأول مرة لبيئات كيميائية غير مستقرة، ابتكرنا هنا ووصف طرقًا للجمع بين تقنية الموائع الدقيقة والتحلل الضوئي، وبالتالي محاكاة التدرجات التي تواجهها البكتيريا البرية في الطبيعة.
تستخدم تقنية Uncaging مسابر حساسة للضوء تغلف الجزيئات الحيوية وظيفياً في شكل غير نشط. التشعيع يطلق الجزيء في قفص، مما يسمح للاضطراب المستهدف من عملية بيولوجية8. بسبب السيطرة السريعة والدقيقة للكيمياء الخلوية التي uncaging يوفر9، وقد تم تقليديا استخدام التدليل الضوئي من المركبات القفص من قبل علماء الأحياء وعلم وظائف الأعضاء وعلماء الأعصاب لدراسة تفعيل الجينات10، قنوات أيون11، والخلايا العصبية12. في الآونة الأخيرة ، استفاد العلماء من المزايا الهامة للانطال الضوئي لدراسة chemotaxis13، لتحديد ديناميات تبديل flagella من الخلايا البكتيرية الفردية المعرضة لتحفيز chemoattractant خطوة خطوة14،15، والتحقيق في أنماط الحركة من الخلايا المنوية واحدة في ثلاثي الأبعاد (3D) التدرجات16.
في نهجنا ، نقوم بتنفيذ التحليل الضوئي للأحماض الأمينية في قفص داخل الأجهزة microfluidic لدراسة الاستجابة السلوكية للسكان البكتيرية للنبضات الكيميائية التي تسيطر عليها ، والتي تصبح متاحة على الفور تقريبا من خلال الإفراج عن الصور. استخدام هدف التكبير المنخفض (4x) (NA = 0.13، عمق التركيز حوالي 40 ميكرومتر) يسمح لكل من مراقبة الاستجابة التجميعية على مستوى السكان لآلاف البكتيريا على مجال رؤية كبير (3.2 مم × 3.2 مم)، وقياس الحركة على مستوى الخلية الواحدة. نقدم تطبيقين لهذه الطريقة: 1) إطلاق نبضة كيميائية واحدة لدراسة ديناميات التراكم البكتيري-تبديد بدءاً من ظروف موحدة، و2)إطلاق نبضات متعددة لتوصيف ديناميات التراكم البكتيري في ظل ظروف جذب كيميائي متفاوتة زمنياً وغير متجانسة مكانياً. وقد تم اختبار هذه الطريقة على البكتيريا البحرية Vibrio ordalii أداء chemotaxis نحو الغلوتامات الأحماض الأمينية17، ولكن هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع على مجموعات مختلفة من الأنواع وchemoattractants ، وكذلك على العمليات البيولوجية وراء chemotaxis (على سبيل المثال ، امتصاص المواد الغذائية ، والتعرض للمضادات الحيوية ، واستشعار النصاب القانوني). يعد هذا النهج بالمساعدة في توضيح إيكولوجيا وسلوك الكائنات الحية الدقيقة في بيئات واقعية والكشف عن المفاضلات الخفية التي تواجهها البكتيريا الفردية عند التنقل في التدرجات الديناميكية الزائلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تسمح هذه الطريقة للباحثين بدراسة الضريبة الكيميائية البكتيرية تحت التدرجات الديناميكية الخاضعة للرقابة في الأجهزة الدقيقة والسائلة، مما يتيح الحصول على بيانات قابلة للتكرار. يهدف الإنشاء شبه الفوري للنبضات الكيميائية على المقياس الدقيق عن طريق التحليل الضوئي إلى إعادة إنتاج أنواع الب…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون أول منشأة تصنيع صغيرة في ETH Zurich. تم دعم هذا العمل من قبل مجلس البحوث الأسترالي اكتشاف في وقت مبكر جائزة الباحث الوظيفي DE180100911 (إلى D.R.B.)، وغوردون وبيتي مور جائزة المحققين مبادرة الميكروبات البحرية GBMF3783 (إلى R.S.)، ومنحة المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم 1-002745-000 (إلى R.S.).
Materials
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
- Armitage, J. P., Lackie, J. M. . The biology of the chemotactic response. , (1991).
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
- Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
- Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
- Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
- Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
- Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
- Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
- Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
- Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
- Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
- Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
- ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
- Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
- Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
- Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
- Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
- . Nikon depth of field calculator Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019)
- Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
- Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
- Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
- Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
- Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).
