미생물 행동을 연구하기 위한 제어된 동적 화학 적 경관 생성
Summary
미세 유체 및 밀리유체 설정 내에서 광용해로 동적 화학 적 경관의 생성을위한 프로토콜이 제시된다. 이 방법론은 운동성 행동, 영양소 섭취 또는 미생물의 화학 물질에 대한 적응을 포함한 다양한 생물학적 과정을 단일 세포 및 집단 수준에서 연구하는 데 적합합니다.
Abstract
우리는 미생물 화학 변균 실험을위한 마이크로 환경을 만들기 위해 지역화 된 화학 력체가 마이크로 스케일에서 갑자기 사용할 수있는 제어 되고 역동적 인 화학 펄스의 생성 방법을 보여줍니다. 화학 적 펄스를 만들기 위해, 우리는 세균 현탁액을 포함하는 다디메틸실록산 (PDMS) 미세 유체 챔버 내에서 케이지 된 아미노산의 광분해에 의해 거의 즉각적으로 아미노산 소스를 소개하는 시스템을 개발했습니다. 우리는 비디오 현미경 검사법에 의해 추적되는 동안 적극적으로 이러한 동적 화학 그라데이션을 등반 할 수있는 화학 박테리아, Vibrio ordalii에이방법을 적용했습니다. 광이동식 보호기와 화학적 변형에 의해 생물학적으로 불활성(‘케이지’)으로 렌더링된 아미노산은 현탁액에 균일하게 존재하지만, UV-A에 가까운 LED 빔을 통해 사용자가 정의한 시간과 공간에서 발생하는 갑작스런 방출까지 는 소비할 수 없습니다. 펄스에서 방출되는 분자의 수는 노출 시간과 분획 해제 분획 사이의 교정 관계에 의해 결정될 수 있으며, 여기서 광용해 후 흡수 스펙트럼은 UV-Vis 분광법을 사용하는 것이 특징입니다. 나노다공성 폴리카보네이트(PCTE) 멤브레인은 미유체 장치로 통합되어 미주된 화합물 및 소비된 매체의 흐름에 의해 연속적으로 제거할 수 있다. PCTE 멤브레인과 PDMS 미세유체 구조 사이의 강력하고 돌이킬 수 없는 결합은 결합될 표면의 플라즈마 활성화에 이어 3-아미노프로필리에톡실란(APTES)의 용액으로 멤브레인을 코팅함으로써 달성된다. 컴퓨터 제어 시스템은 서로 다른 위치와 다른 강도의 사용자 정의 펄스 시퀀스를 생성하여 규정된 공간 및 시간적 가변성을 가진 리소스 풍경을 생성할 수 있습니다. 각 화학 적 풍경에서, 개별 규모에서 세균 운동의 역학 및 인구 수준에서의 축적을 얻을 수 있습니다.
Introduction
미생물은 화학 적 구배를 감지하고 반응1에서운동성을 수정하는 과정인 화학 요법에 의존하여 화학 적 경관을 탐색하고 영양공급원과 숙성에 접근하고 유해 물질을 탈출합니다. 이러한 마이크로 스케일 프로세스는 미생물과 환경 간의 상호 작용의 거시 적 역학을 결정2,3. 최근 연질 리소그래피4를포함한 미세 유체학 및 미세 제조 기술의 발전은 미생물의 상호 작용을 연구할 수 있는 제어된 미세 환경을 만드는 우리의 능력에 혁명을 일으켰습니다. 예를 들어, 과거 실험에서는 중급에서 고영양농도의 고도로 조절되고 안정된 그라데이션을 생성하여 세균화학을 연구한5,6. 그러나 자연 환경에서는 미세 크기의 화학 그라데이션이 단명할 수 있으며 분자 확산에 의해 소멸될 수 있으며 배경 조건은 종종 매우희석되어 7. 불안정한 화학 환경에 처음 노출된 미생물 집단의 화학반응을 직접 측정하기 위해 미세 유체 기술과 광분해를 결합하여 야생 박테리아가 자연에서 마주치는 그라데이션을 모방하는 방법을 고안하고 여기에 설명했습니다.
Uncaging 기술은 생체 분자를 비활성 형태로 기능적으로 캡슐화하는 빛에 민감한 프로브를 사용합니다. 조사는 갇힌 분자를 방출하여 생물학적 과정의 표적 교란을허용8. 세포 화학의 신속하고 정밀한 제어로 인하여9,케이지 화합물의 광분석은 전통적으로 생물학자, 생리학자 및 신경과학자들에 의해 유전자10,이온 채널11,및 뉴런12의활성화를 연구하기 위해 사용되어 왔다. 최근 과학자들은화학요법(13)을연구하기 위해 광분해의 유의한 장점을 활용하고, 단계별 화학력 자극14,15에노출된 개별 세균 세포의 편동기 전환 역학을 결정하고, 3차원(3D) 그라데이션16에서단일 정자 세포의 운동성 패턴을 조사하였다.
우리의 접근에서는, 우리는 광유체 장치 내의 케이지된 아미노산의 광용해를 구현하여 광방출을 통해 거의 즉각적으로 이용 가능해지는 제어된 화학 펄스에 대한 세균 집단의 행동 반응을 연구합니다. 저배율(4x) 목적(NA = 0.13, 초점 깊이 약 40 μm)을 사용하면 넓은 시야(3.2 mm x 3.2 mm)에서 수천 개의 박테리아의 집단 수준 집계 반응을 관찰하고 단일 셀 수준에서 모션을 측정할 수 있습니다. 우리는이 방법의 두 가지 응용 프로그램을 제시: 1) 균일 한 조건에서 시작 하는 박테리아 축적-발산 역학을 연구 하는 단일 화학 펄스의 릴리스, 그리고 2i)시간 변화 하에서 세균 축적 역학을 특성화 하는 다중 펄스의 릴리스, 공간적으로 이질적인 화학 력 조건. 이 방법은 아미노산글루타메이트(17)를향한 화학탁증을 수행하는 해양 박테리아 비브리오 오르달리에 대해 시험되었지만, 이 방법은 화학적 화학요법(예를 들어, 영양 섭취, 항생제 노출, 쿼럼 센싱)을 넘어서는 생물학적 과정뿐만 아니라 종 및 화학유량의 상이한 조합에 광범위하게 적용가능하다. 이 접근법은 현실적인 환경에서 미생물의 생태와 행동을 해명하고 일시적인 동적 그라데이션을 탐색 할 때 개별 박테리아가 직면하는 숨겨진 절충을 밝히는 데 도움이 될 것을 약속합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법을 통해 연구원은 마이크로 및 밀리플루언스 장치에서 제어되고 동적 그라데이션하에서 세균 성 화학 요법을 연구하여 재현 가능한 데이터 수집을 가능하게합니다. 광분해에 의한 마이크로스케일에서 의한 화학펄스의 거의 즉각적인 생성은 박테리아가 다양한 소스로부터 야생에서 발생하는 영양소 펄스의 유형을 재현하는 것을 목표로 하며, 예를 들어, 가라앉는 해양입자(2…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 ETH 취리히에서 첫 번째 미세 가공 시설에 감사드립니다. 이 작품은 호주 연구위원회 발견 초기 경력 연구원 상 DE180100911 (D.R.B.), 고든과 베티 무어 해양 미생물 이니셔티브 조사자 상 GBMF3783 (R.S.에), 스위스 국립 과학 재단 보조금에 의해 지원되었다 1-002745-000 (R.S.로)
Materials
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
- Armitage, J. P., Lackie, J. M. . The biology of the chemotactic response. , (1991).
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
- Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
- Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
- Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
- Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
- Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
- Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
- Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
- Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
- Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
- Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
- ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
- Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
- Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
- Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
- Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
- . Nikon depth of field calculator Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019)
- Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
- Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
- Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
- Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
- Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).
