יצירת מבוקרת, נופים כימיים דינמי ללמוד התנהגות מיקרוביאלית
Summary
פרוטוקול לדור של נופים כימיים דינמיים על ידי פוטוליזה בתוך microfluidic והגדרות מיליפלואידיג מוצג. מתודולוגיה זו מתאימה לחקר תהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל התנהגות נעים, ספיגת מזינים, או הסתגלות לכימיקלים של מיקרואורגניזמים, הן בתא יחיד ברמת האוכלוסייה.
Abstract
אנו מדגימים שיטה עבור הדור של מבוקרת, פולסים כימיים דינאמיים-שם כימוסטנט מקומי הופך לפתע זמין במיקרוסקאלה – כדי ליצור מיקרו סביבות עבור ניסויים כימוקיים חיידקים. כדי ליצור פולסים כימיים, פיתחנו מערכת להחדיר מקורות חומצות אמינו בסמוך-מיידי על ידי פוטוליזה של חומצות אמינו בכלוב בתוך polydiמתיל siloxane (pdms) תא מיקרופלואידיג המכיל השעיה בקטריאלי. החלתי שיטה זו לחיידק כימוטקטקטיקה, Vibrio ordalii, אשר יכול באופן פעיל לטפס על מעברי הצבע הכימיים הדינאמיים האלה בעת במעקב על ידי וידאו מיקרוסקופ. חומצות אמינו, מעובד ביולוגית (‘ כלוב ‘) על ידי שינוי כימי עם הקבוצה הגנה photoremovable, הם באופן אחיד בהשעיה אך לא זמין עבור הצריכה עד שחרורו הפתאומי שלהם, אשר מתרחשת בנקודות מוגדרות על-ידי המשתמש בזמן ובמרחב באמצעות קרן LED ממוקדת כמעט-UV. מספר המולקולות שפורסמו בדופק יכול להיקבע על ידי קשר כיול בין זמן חשיפה ושבריר הזדקנות, שם ספקטרום הקליטה לאחר פוטוליזה מאופיין באמצעות ספקטרוסקופיה UV-Vis. פוליקרבונט nanפורטו (PCTE) קרום יכול להיות משולב לתוך המכשיר microflu, כדי לאפשר את ההסרה רציפה על ידי זרימה של תרכובות בכלוב ללא כלוב ואת התקשורת המושקע. הקשר חזק, בלתי הפיך בין קרום PCTE לבין מבנה מיקרופלואידיג PDMS מושגת על ידי ציפוי הקרום עם פתרון של 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) ואחריו הפעלה פלזמה של משטחים להיות מאוחדים. מערכת הנשלטת על-ידי מחשב יכולה ליצור רצפים מוגדרים על-ידי המשתמש במיקומים שונים ובעוצמות שונות, כדי ליצור נופי משאבים עם השתנות מרחבית ושינויים בזמן הזמני. בכל נוף כימי, הדינמיקה של התנועה החיידקית בקנה המידה הפרטני וההצטברות שלהם ברמת האוכלוסייה ניתן להשיג, ובכך לאפשר את הקוונפיקציה של ביצועי השיטה ואת השפעותיו על הצטברות חיידקים בסביבות רלוונטיות אקולוגית.
Introduction
חיידקים להסתמך על כימוטווניות, התהליך של זיהוי הדרגתיים כימיים ושינוי תנועתיות בתגובה1, כדי לנווט נופים כימיים, גישה מקורות מזינים ומארחים, ולברוח חומרים רעילים. תהליכי מיקרוסקאלה אלה קובעים את הקינטיקה המקרו-שלמה של אינטראקציות בין חיידקים לסביבתם2,3. ההתפתחויות האחרונות במיקרופלואידיקה וטכנולוגיות מיקרוייצור, כולל ליתוגרפיה רכה4, יש מהפכה היכולת שלנו ליצור מיקרו סביבות מבוקרת שבו ללמוד את האינטראקציות של חיידקים. לדוגמה, ניסויים בעבר למדו כימוטקיית בקטריאלי על ידי יצירת בשליטה גבוהה, מעברי צבע יציבים של ביניים ריכוז מזינים גבוה5,6. עם זאת, בסביבות טבעיות, מעברי צבע כימיים מיקרוסולם יכול להיות קצר חיים-התפוגג על ידי דיפוזיה מולקולרית-ואת תנאי הרקע הם לעיתים קרובות מדלל מאוד7. כדי למדוד באופן ישיר את תגובת כימוטקטקטיקה של אוכלוסיות חיידקים נחשף תחילה לסביבות כימיות בלתי יציבות, המציאו וכאן לתאר שיטות כדי לשלב טכנולוגיה microflu, עם photolysis, ובכך לחקות מעברי צבע כי חיידקים פראי המפגש בטבע.
טכנולוגיית הזדקנות מעסיקה בדיקה רגישה באור אשר מכמס פונקציונלית biomolecules בצורה לא פעילה. הקרנה משחררת את המולקולה הכלובית ומאפשרת את המיקוד המכוון של תהליך ביולוגי8. בשל השליטה המהירה והמדויקת של הכימיה התאית שההזדקנות מעניקה לה9, פוטוליזה של תרכובות בכלוב הועסק באופן מסורתי על ידי ביולוגים, פיזיקולוגים ומדענים נוירולוגים לחקור את הפעלת גנים10, יון ערוצים11, ונוירונים12. לאחרונה, מדענים יש מינוף את היתרונות המשמעותיים של פוטוליזה ללמוד כימותוניות13, כדי לקבוע את הדינמיקה החלפת הדגלים של תאים חיידקיים בודדים נחשף לגירוי ממושך של כימוסטנט14,15, ולחקור דפוסי תנועתיות של תאים זרע אחד בתלת מימדי (3d) מעברי צבע16.
בגישה שלנו, אנו מיישמים פוטוליזה של חומצות אמינו בכלוב בתוך התקנים microflu, כדי ללמוד את התגובה ההתנהגותית של אוכלוסיה חיידקית לפולסים כימיים מבוקרים, אשר הופכים כמעט מיידי זמין באמצעות photorהפצה. השימוש של מטרה בהגדלה נמוכה (4x) (NA = 0.13, עומק של מיקוד כ 40 μm) מאפשר הן את ההתבוננות של התגובה ברמת האוכלוסייה של אלפי חיידקים מעל שדה גדול של נוף (3.2 mm x 3.2 מ”מ), ואת מדידת התנועה ברמה של תא בודד. אנו מציגים שני יישומים של שיטה זו: 1) שחרורו של פעימה כימית אחת כדי ללמוד הצטברות חיידקי לפיזור הדינמיקה החל בתנאים אחיד, ו 2אני) שחרורו של פולסים מרובים כדי לאפיין את הדינמיקה הצטברות חיידקים תחת זמן שונים, הטרוגנית הטרוגניות התנאים כימוסטנט. שיטה זו נבדקה על החיידקים הימיים Vibrio כימוא ביצוע מוניות לכיוון גלוטמט חומצות אמינו17, אבל השיטה היא ישימה באופן כללי על שילובים שונים של מינים וכימורים, כמו גם תהליכים ביולוגיים מעבר כימוקווניות (למשל, ספיגת מזינים, חשיפה לאנטיביוטיקה, מקווחישה). גישה זו מבטיחה לעזור להבהיר את האקולוגיה ואת ההתנהגות של מיקרואורגניזמים בסביבות ריאליסטי ולחשוף את הסחר הנסתר כי חיידקים בודדים הפנים בעת ניווט מעברי צבע דינמי ארעי.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור כימוטוניות חיידקי תחת נשלט, מעברי צבע דינמיים במכשירים מיקרו ו-מיליפלואידיג, המאפשר רכישת נתונים שאינם מפוקחים. היצירה הכמעט-מיידית של פולסים כימיים במיקרוסקאלה על ידי פוטוליזה שואפת לשכפל את סוגי פולסים תזונתיים כי חיידקים מפגש פראי מתוך מגוון של מקורות, למ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למתקן המיקרוייצור הראשון ב-ETH ציריך. עבודה זו נתמכת על ידי מועצת המחקר האוסטרלי החוקר הקריירה הקדומה פרס DE180100911 (כדי D.R.B.), גורדון ובטי מור היוזמה הימית פרס החוקר GBMF3783 (כדי R.S.), ו שוויצרי קרן המדע הלאומי המענק 1-002745-000 (לR.S.).
Materials
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
- Armitage, J. P., Lackie, J. M. . The biology of the chemotactic response. , (1991).
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
- Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
- Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
- Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
- Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
- Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
- Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
- Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
- Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
- Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
- Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
- ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
- Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
- Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
- Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
- Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
- . Nikon depth of field calculator Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019)
- Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
- Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
- Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
- Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
- Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).
