Generering af kontrollerede, dynamiske kemiske landskaber til undersøgelse af mikrobiel adfærd
Summary
En protokol for produktion af dynamiske kemiske landskaber ved fotolyse inden for mikrofluidic og millifluidic opsætninger præsenteres. Denne metode er velegnet til at studere forskellige biologiske processer, herunder motiladfærd, optagelse af næringsstoffer eller tilpasning til kemikalier af mikroorganismer, både på enkeltcelle- og befolkningsniveau.
Abstract
Vi demonstrerer en metode til generering af kontrollerede, dynamiske kemiske impulser – hvor lokaliseret kemoattractant pludselig fås på mikroskalaen – for at skabe mikromiljøer til mikrobielle kemotaxiseksperimenter. For at skabe kemiske impulser udviklede vi et system til at indføre aminosyrekilder nær øjeblikkeligt ved fotolyse af aminosyrer i bur i et polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidic kammer, der indeholder en bakteriel suspension. Vi anvendte denne metode til kemotactic bakterien, Vibrio ordalii, som aktivt kan klatre disse dynamiske kemiske gradienter og samtidig spores af video mikroskopi. Aminosyrer, gengivet biologisk inert (‘bur’) ved kemisk modifikation med en fotoaftagelig beskyttende gruppe, er ensartet til stede i suspensionen, men ikke tilgængelig til forbrug, indtil deres pludselige frigivelse, som opstår på brugerdefinerede tidspunkter i tid og rum ved hjælp af en nær-UV-A fokuseret LED stråle. Antallet af molekyler, der frigives i pulsen, kan bestemmes af en kalibreringsforhold mellem eksponeringstid og brudfraktion, hvor absorptionsspektret efter fotolyse er karakteriseret ved hjælp af UV-Vis spektroskopi. En nanoporøs polycarbonatmembran (PCTE) kan integreres i den mikrofluidiske enhed, så den kontinuerlige fjernelse af de uncaged-forbindelser og de brugte medier kan fjernes kontinuerligt. En stærk, irreversibel binding mellem PCTE membranen og PDMS mikrofluidic struktur opnås ved belægning membranen med en opløsning af 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) efterfulgt af plasma aktivering af overflader, der skal bindes. Et computerstyret system kan generere brugerdefinerede sekvenser af impulser på forskellige steder og med forskellige intensiteter, så der skabes ressourcelandskaber med foreskrevne rumlige og tidsmæssige variationer. I hvert kemisk landskab kan dynamikken i bakteriebevægelsen i den enkelte skala og deres akkumulering på befolkningsniveau opnås, hvilket gør det muligt at kvantificere kemotaktisk ydeevne og dens virkninger på bakteriesammenlægninger i økologisk relevante miljøer.
Introduction
Mikrober er afhængige af kemotaxis, processen med at opdage kemiske gradienter og ændre motilitet som reaktion1, at navigere kemiske landskaber, tilgang næringsstof kilder og værter, og undslippe skadelige stoffer. Disse mikroskalaprocesser bestemmer makroskalakinetik af interaktioner mellem mikrober og deres miljø2,3. De seneste fremskridt inden for mikrofluidik og mikrofabrikationsteknologier, herunder blød litografi4,har revolutioneret vores evne til at skabe kontrollerede mikromiljøer til at studere samspillet mellem mikrober. For eksempel har tidligere forsøg studeret bakterielke kemotaxis ved at generere stærkt kontrollerede, stabile gradienter af mellemliggende til høje næringsstofkoncentrationer5,6. I naturlige miljøer kan mikroskalakemiske gradienter dog være kortvarige – spredes ved molekylær diffusion – og baggrundsforholdene er ofte meget fortyndet7. For direkte at måle den kemotaktiske reaktion af mikrobielle populationer, der først blev udsat for ustabile kemiske miljøer, udtænkte vi og beskriver her metoder til at kombinere mikrofluidic-teknologi med fotolyse og dermed efterligne gradienter, som vilde bakterier støder på i naturen.
Uncaging teknologi anvender lysfølsomme sonder, der funktionelt indkapsler biomolekyler i en inaktiv form. Bestråling frigiver molekylet i buret, hvilket gør det muligt at forstyrre en biologisk proces8. På grund af den hurtige og præcise kontrol af cellulære kemi, at udbåren giver9, fotolyse af bur forbindelser har traditionelt været ansat af biologer, fysiologer og neuroforskere til at studere aktivering af gener10, ion kanaler11, og neuroner12. For nylig har forskerne udnyttet de betydelige fordele ved fotolyse til at studere kemotaxis13, at bestemme flagella skifte dynamik enkelte bakterieceller udsat for en trinvis kemoattractant stimulus14,15, og at undersøge motilitet mønstre af enkelt sædceller celler i tre-dimensionelle (3D) gradienter16.
I vores tilgang implementerer vi fotolyse af buraminosyrer inden for mikrofluidic enheder for at studere en bakteriebestands adfærdsmæssige reaktion på kontrollerede kemiske impulser, som bliver næsten øjeblikkeligt tilgængelige via fotoudgivelse. Anvendelsen af et mål med lav forstørrelse (4x) (NA = 0,13, fokusdybde ca. 40 μm) gør det muligt både at observation af aggregeringiv respons på befolkningsniveau for tusindvis af bakterier over et stort synsfelt (3,2 mm x 3,2 mm) og måling af bevægelse på enkeltcelleniveau. Vi præsenterer to anvendelser af denne metode: 1) frigivelse af en enkelt kemisk puls til at studere bakteriel akkumulering−dissipation dynamik fra ensartede forhold, og 2i) frigivelse af flere impulser til at karakterisere bakteriel akkumulering dynamik under tidsvarierende, rumligt heterogene kemoattractant betingelser. Denne metode er blevet testet på de marine bakterier Vibrio ordalii udfører kemotaxis mod aminosyren glutamat17,men metoden er stort set gældende for forskellige kombinationer af arter og kemoattractants, samt biologiske processer ud over kemotaxis (f.eks næringsstof optagelse, antibiotika eksponering, kvorum sensing). Denne tilgang lover at hjælpe med at belyse økologi og adfærd mikroorganismer i realistiske miljøer og at afdække de skjulte kompromiser, at de enkelte bakterier står over for, når du navigerer flygtige dynamiske gradienter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne metode gør det muligt for forskere at studere bakterielke kemotaxis under kontrollerede, dynamiske gradienter i mikro- og millifluidic enheder, så reproducerbare dataindsamling. Den næsten øjeblikkelige skabelse af kemiske impulser på mikroskala ved fotolyse har til formål at reproducere de typer af næringsstoffer pulser, bakterier støder på i naturen fra en række kilder, for eksempel, diffusive spredning af fjer bag synkende marine partikler25, eller næringsstof spredning fra lys…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker den første mikrofabrikation facilitet på ETH Zürich. Dette arbejde blev støttet af en australsk Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (til D.R.B.), en Gordon og Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (til RS), og en schweizisk National Science Foundation tilskud 1-002745-000 (til R.S.).
Materials
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
- Armitage, J. P., Lackie, J. M. . The biology of the chemotactic response. , (1991).
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
- Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
- Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
- Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
- Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
- Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
- Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
- Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
- Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
- Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
- Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
- ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
- Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
- Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
- Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
- Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
- . Nikon depth of field calculator Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019)
- Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
- Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
- Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
- Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
- Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).
