Générer des paysages chimiques contrôlés et dynamiques pour étudier le comportement microbien

Summary

Un protocole pour la génération de paysages chimiques dynamiques par photolyse dans des configurations microfluidiques et millifluidiques est présenté. Cette méthodologie est appropriée pour étudier divers processus biologiques, y compris le comportement motile, l’absorption des nutriments, ou l’adaptation aux produits chimiques des micro-organismes, à la fois au niveau de la cellule unique et au niveau de la population.

Abstract

Nous démontrons une méthode pour la génération des impulsions chimiques contrôlées et dynamiques, où le chimioattractant localisé devient soudainement disponible à l’échelle micro-pour créer des micro-environnements pour des expériences microbiennes de chimiotaxis. Pour créer des impulsions chimiques, nous avons développé un système pour introduire des sources d’acides aminés quasi-instantanément par photolyse d’acides aminés en cage dans une chambre microfluidique de polydiméthylsiloxane (PDMS) contenant une suspension bactérienne. Nous avons appliqué cette méthode à la bactérie chimiotaxique, Vibrio ordalii, qui peut gravir activement ces gradients chimiques dynamiques tout en étant suivi par microscopie vidéo. Les acides aminés, rendus biologiquement inertes («caged») par modification chimique avec un groupe de protection photomovible, sont uniformément présents dans la suspension, mais pas disponibles pour la consommation jusqu’à leur libération soudaine, qui se produit à des points définis par l’utilisateur dans le temps et l’espace au moyen d’un faisceau LED axé sur les UV-A. Le nombre de molécules libérées dans l’impulsion peut être déterminé par une relation d’étalonnage entre le temps d’exposition et la fraction non-curation, où le spectre d’absorption après la photolyse est caractérisé par l’utilisation de la spectroscopie UV-Vis. Une membrane de polycarbonate nanoporeux (PCTE) peut être intégrée dans le dispositif microfluidique pour permettre l’élimination continue par l’écoulement des composés non encages et du support usé. Un lien fort et irréversible entre la membrane PCTE et la structure microfluidique PDMS est atteint en enrobant la membrane d’une solution de 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) suivie d’une activation plasmatique des surfaces à cautionr. Un système contrôlé par ordinateur peut générer des séquences d’impulsions définies par l’utilisateur à différents endroits et avec des intensités différentes, de manière à créer des paysages de ressources avec la variabilité spatiale et temporelle prescrite. Dans chaque paysage chimique, la dynamique du mouvement bactérien à l’échelle individuelle et leur accumulation au niveau de la population peuvent être obtenues, permettant ainsi la quantification de la performance chimiothérapeutique et ses effets sur les agrégations bactériennes dans des environnements écologiquement pertinents.

Introduction

Les microbes s’appuient sur la chimiotaxie, le processus de détection des gradients chimiques et la modification de la motilité en réponse¹, pour naviguer dans les paysages chimiques, approcher les sources nutritives et les hôtes, et échapper aux substances nocives. Ces processus à l’échelle micrométrique déterminent la cinétique macro-échelle des interactions entre les microbes et leur environnement^2,3. Les progrès récents dans les technologies de microfluidique et de microfabrication, y compris la lithographie douce⁴, ont révolutionné notre capacité à créer des microenvironnements contrôlés dans lesquels étudier les interactions des microbes. Par exemple, des expériences antérieures ont étudié la chimiotaxie bactérienne en générant des gradients stables et hautement contrôlés de concentrations de nutriments intermédiaires à élevés^5,6. Cependant, dans les environnements naturels, les gradients chimiques à l’échelle micrométrique peuvent être de courte durée, dissipées par la diffusion moléculaire, et les conditions de fond sont souvent très diluées⁷. Pour mesurer directement la réponse chimiothérapeutique des populations microbiennes d’abord exposées à des environnements chimiques instables, nous avons conçu et décrit ici des méthodes pour combiner la technologie microfluidique avec la photolyse, imitant ainsi les gradients que les bactéries sauvages rencontrent dans la nature.

La technologie de déballage utilise des sondes sensibles à la lumière qui encapsulent fonctionnellement des biomolécules sous une forme inactive. L’irradiation libère la molécule en cage, permettant la perturbation ciblée d’un processus biologique⁸. En raison du contrôle rapide et précis de la chimie cellulaire que le démantèle permet⁹, la photolyse des composés en cage a traditionnellement été utilisé par les biologistes, les physiologistes et les neuroscientifiques pour étudier l’activation des gènes¹⁰, canaux ioniques¹¹, et les neurones¹². Plus récemment, les scientifiques ont mis à profit les avantages significatifs de la photolyse pour étudier la chimiotaxie¹³, pour déterminer la dynamique de commutation de flagelle des cellules bactériennes individuelles exposées à un stimulus chimioattractant étape^14,15, et d’étudier les modèles de motilité des spermatozoïdes simples dans les gradients tridimensionnels (3D)¹⁶.

Dans notre approche, nous mettons en œuvre la photolyse des acides aminés en cage dans les dispositifs microfluidiques pour étudier la réponse comportementale d’une population bactérienne aux impulsions chimiques commandées, qui deviennent presque instantanément disponibles par photorelease. L’utilisation d’un objectif de faible grossissement (4x) (NA – 0,13, profondeur de mise au point d’environ 40 m) permet à la fois l’observation de la réponse agrégative au niveau de la population de milliers de bactéries sur un grand champ de vision (3,2 mm x 3,2 mm), et la mesure du mouvement au niveau d’une seule cellule. Nous présentons deux applications de cette méthode : 1) la libération d’une impulsion chimique unique pour étudier la dynamique bactérienne d’accumulation-dissipation à partir de conditions uniformes, et 2i) la libération des impulsions multiples pour caractériser la dynamique d’accumulation bactérienne dans des conditions de chimioattractant séquentitentes et spatialement variables et spatialement. Cette méthode a été testée sur la bactérie marine Vibrio ordalii effectuant des chimiotaxis vers le glutamate d’acide aminé¹⁷, mais la méthode est largement applicable à différentes combinaisons d’espèces et de chimioattractants, ainsi qu’à des processus biologiques au-delà de la chimiotaxie (p. ex., absorption des nutriments, exposition aux antibiotiques, détection du quorum). Cette approche promet d’aider à élucider l’écologie et le comportement des micro-organismes dans des environnements réalistes et de découvrir les compromis cachés auxquels les bactéries individuelles sont confrontées lorsqu’elles naviguent dans des gradients dynamiques éphémères.

Protocol

1. Fabrication du dispositif microfluidique pour l’expérience à impulsion chimique unique Concevez le canal à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAD) et imprimez-le sur un film de transparence pour créer le masque photo (Figure 1A). Fabriquer le maître par lithographie douce (dans des conditions de chambre propre). Nettoyer une plaquette de silicium (4 pouces) en succession rapide avec de l’acétone, du méthanol et …

Representative Results

Nous avons utilisé les dispositifs microfluidiques et millifluidiques (Figure 1) pour étudier les profils d’accumulation bactérienne dans des conditions nutritives dynamiques. Les trajectoires bactériennes ont été extraites de vidéos enregistrées acquises par microscopie de contraste de phase de la dynamique accumulation-dissipation d’une population bactérienne à la suite d’une impulsion chimique libérée par photolyse(figure 2 et <strong class="xfig"…

Discussion

Cette méthode permet aux chercheurs d’étudier les chimiotaxis bactériens sous des gradients dynamiques contrôlés dans des dispositifs micro et millifluidiques, permettant l’acquisition de données reproductibles. La création quasi instantanée d’impulsions chimiques à l’échelle micrométrique par photolyse vise à reproduire les types d’impulsions nutritives que les bactéries rencontrent à l’état sauvage à partir d’une gamme de sources, par exemple, la diffusion diffuse des panaches derrière les particules m…

Materials

(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)	Sigma-Aldrich	A3648	>98% purity, highly toxic
CELLSTAR tube	Greiner Bio-One	210261	50 ml
Centrifuge	Eppendorf	5424R	to eliminate spent media from the bacterial culture
Digital Incubators Incu-Line	VWR-CH	390-0384	to bake 3D master
Duster	VWR-CH	16650-22	to clean the wafer and microchannels
Hot plate	VWR-CH	444-0601	to bond the microchannels
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292907
LightSafe micro centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	Z688312	1.5 ml
MATLAB	Mathworks		for image analysis and bacterial tracking
Microcentrifuge tube	Eppendorf	30120086	1.5 ml
Microscope glass slide	VWR-CH	631-1552
Microscope Nikon Eclipse TiE	Nikon Instruments	MEA53100	with motorized stage
MNI-Glutamate	Tocris Bioscience	1490	>98 % purity, photosensitive
Mold printing equipment	Stratasys		Objet30 3D printer
Mold printing service	3D Printing Studios	Custom	https://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	to calibrate the uncaging
NIS Elements	Nikon Instruments		Microscope Imaging Software
Oven Venti-Line	VWR-CH	466-3516	to bake PDMS (with forced convection)
Photoresist SU-8-3050	MicroChem Corp.	SU8-3050
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	to functionalize the surfaces before bonding
Polycarbonate membrane	Sterlitech	PCT0447100	0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness
Polyethylene microtubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/2	I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm
Polystyrene Petri dish	VWR-CH	25373-100	bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device
Scale	VWR-CH	611-2605	to weight PDMS mixture
sCMOS camera Andor Zyla	Oxford Instruments		for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)
Sea salt	Instant Ocean	Product No. SS1-160p
SolidWorks 2015	Dassault Systemes SolidWorks		Used to design the mold
Spectra X light engine	Lumencolor		for LED 395 nm
Sylgard 184	Dow Corning	110-41-155	PDMS Si Elastomer Kit; curing agent
Syringe (Luer-Lok)	B Braun Omnifix	4616308F
Syringe Needle	Agani	A228	from 10 to 30 ml
Syringe Pump 11 Pico Plus Elite	Harvard Apparatus	70-4506	Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)
VeroGrey	Stratasys		Dual Syringe Pump
Vortex-Genie	Scientific Industries	SI-0236	Mold Material