Создание контролируемых, динамических химических ландшафтов для изучения микробного поведения
Summary
Представлен протокол для генерации динамических химических ландшафтов с помощью фотолиза в микрофлюидных и миллифлюдических установках. Эта методология подходит для изучения различных биологических процессов, включая подвижное поведение, поглощение питательных веществ или адаптацию к химическим веществам микроорганизмов, как на уровне одной клетки, так и на уровне популяции.
Abstract
Мы демонстрируем метод генерации контролируемых динамических химических импульсов, при котором локализованный хемоатантант внезапно становится доступным в микромасштабе для создания микро-сред для экспериментов по микробным химиотаксисам. Для создания химических импульсов мы разработали систему для введения аминокислотных источников почти мгновенно фотолиза клетчатых аминокислот в микрофлюидной камере полиметилсилоксана (PDMS), содержащей бактериальную суспензию. Мы применили этот метод к химиотаксической бактерии, Vibrio ordalii, которые могут активно подниматься эти динамические химические градиенты, будучи отслеживается видеомикроскопией. Аминокислоты, оформляемые биологически инертными (‘клетками’) химической модификацией с фоторедвижутой защитной группой, равномерно присутствуют в подвеске, но не доступны для потребления до их внезапного выброса, которое происходит в определенных пользователем точках во времени и пространстве с помощью почти УФ-А сфокусированного светодиодного луча. Количество молекул, выделяемых в пульсе, может быть определено путем калибровки между временем воздействия и нестыкающейся фракцией, где спектр поглощения после фотолиза характеризуется использованием УФ-Вис спектроскопии. Нанопоросая поликарбонатная (PCTE) мембрана может быть интегрирована в микрофлюидное устройство, чтобы позволить непрерывное удаление потоком неизлечимых соединений и отработанных носителей. Сильная, необратимая связь между мембраной PCTE и микрофлюидной структурой PDMS достигается путем покрытия мембраны раствором 3-аминопропилтриэтитоксилана (APTES), за которым следует плазменная активация поверхностей, которые должны быть связаны. Управляемая компьютером система может генерировать пользовательские последовательности импульсов в разных местах и с разной интенсивностью, с тем чтобы создать ресурсные ландшафты с предписанной пространственной и временной изменчивостью. В каждом химическом ландшафте можно получить динамику бактериального движения в индивидуальном масштабе и их накопление на уровне популяции, что позволяет количественно определить химиотаксическую эффективность и ее воздействие на бактериальные агрегаты в экологически значимых средах.
Introduction
Микробы полагаются на хемотаксис, процесс обнаружения химических градиентов и изменения подвижности в ответ1, для навигации химических ландшафтов, подход источников питательных веществ и хостов, и избежать вредных веществ. Эти микромасштабные процессы определяют макромасштабную кинетику взаимодействий между микробами и их окружающей средой2,3. Последние достижения в области микрофлюитики и технологий микрофабрикации, включая мягкую литографию4,произвели революцию в нашей способности создавать управляемые микросреды, в которых можно изучать взаимодействие микробов. Например, прошлые эксперименты изучали бактериальный химиотаксис, генерируя высококонтролируемые, стабильные градиенты промежуточных и высоких концентраций питательных веществ5,6. Тем не менее, в естественной среде, микромасштабные химические градиенты могут быть недолговечными, рассеяны молекулярной диффузией, а фоновые условия часто сильно разбавляют7. Чтобы непосредственно измерить химиотаксическую реакцию микробных популяций, впервые подвергшихся воздействию нестационарной химической среды, мы разработали и здесь описали методы объединения микрофлюидной технологии с фотоизисом, тем самым имитируя градиенты, с которыми встречаются дикие бактерии в природе.
Технология uncaging использует светочувствительные зонды, которые функционально инкапсулируют биомолекулы в неактивной форме. Облучение высвобождает клетку молекулы, что позволяет целенаправленное возмущение биологического процесса8. Из-за быстрого и точного контроля клеточной химии, что uncaging дает9, фотолиза в клетке соединений традиционно используется биологами, физиологами и нейробиологами для изучения активации генов10, ионных каналов11, и нейронов12. Совсем недавно, ученые использовали значительные преимущества фотолиза для изучения химиотаксиса13, чтобы определить флагеллы переключения динамики отдельных бактериальных клеток подвергаются пошаговой химиоаттованта стимул14,15, и для изучения моделей подвижности одиночных клеток спермы в трехмерных (3D) градиентов16.
В нашем подходе мы внедряем фотоиз аминокислот в клетке в микрофлюидных устройствах для изучения поведенческой реакции бактериальной популяции на контролируемые химические импульсы, которые становятся почти мгновенно доступными с помощью фоторелиза. Использование цели с низким увеличением (4x) (NA 0.13, глубина фокусировки приблизительно 40 мкм) позволяет как наблюдать агрегационную реакцию тысяч бактерий на уровне населения на большом поле зрения (3,2 мм х 3,2 мм), так и измерение движения на одноклеточном уровне. Мы представляем два применения этого метода: 1) выпуск одного химического импульса для изучения бактериального накопления-динамики рассеивания, начиная с однородных условий, и 2i) выпуск нескольких импульсов, чтобы охарактеризовать динамику бактериального накопления в соответствии с временем-изменяющихся, пространственно неоднородных химиоаттантов условиях. Этот метод был протестирован на морских бактерий Vibrio ordalii выполнения химиотаксиса к аминокислоте глутамата17, но метод широко применим к различным комбинациям видов и хемоаттантов, а также к биологическим процессам за химиотаксис (например, поглощение питательных веществ, воздействие антибиотиков, кворум зондирования). Этот подход обещает помочь прояснить экологию и поведение микроорганизмов в реалистичной среде и раскрыть скрытые компромиссы, с которыми сталкиваются отдельные бактерии при навигации по эфемерным динамическим градиентам.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод позволяет исследователям изучать бактериальный хемотаксис под контролируемыми, динамическими градиентами в микро- и миллифлюидных устройствах, что позволяет воспроизводимое получение данных. Почти мгновенное создание химических импульсов на микромасштабе путем фотолиз?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят первый объект микрофабрикации в ETH Цюрихе. Эта работа была поддержана Австралийский научно-исследовательский совет Discovery Ранняя карьера Исследователь премии DE180100911 (d.R.B.), Гордон и Бетти Мур морской микробной инициативы Следователь премии GBMF3783 (в Р.С.), и Швейцарский национальный научный фонд грант 1-002745-000 (до Р.С.).
Materials
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
- Armitage, J. P., Lackie, J. M. . The biology of the chemotactic response. , (1991).
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
- Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
- Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
- Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
- Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
- Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
- Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
- Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
- Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
- Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
- Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
- ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
- Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
- Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
- Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
- Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
- . Nikon depth of field calculator Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019)
- Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
- Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
- Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
- Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
- Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).
