Bewertung der akuten Wundheilung mit den dorsalen subkutanen Polyvinylalkoholschwammimplantation und Exzisional Tail Skin Wound Models.
Summary
Hier werden zwei murine Wundheilungsmodelle beschrieben, eines zur Beurteilung der zellulären und zytokinen Wundheilungsreaktionen und das andere zur Quantifizierung der Rate des Wundverschlusses. Diese Methoden können mit komplexen Krankheitsmodellen wie Diabetes verwendet werden, um Mechanismen verschiedener Aspekte der schlechten Wundheilung zu bestimmen.
Abstract
Wundheilung ist ein komplexer Prozess, der das geordnete Fortschreiten von Entzündungen, Granulationsgewebebildung, Fibrose und Auflösung erfordert. Murine Modelle bieten wertvolle mechanistische Einblicke in diese Prozesse; Kein einziges Modell berücksichtigt jedoch alle Aspekte der Wundheilungsreaktion vollständig. Stattdessen ist es ideal, mehrere Modelle zu verwenden, um die verschiedenen Aspekte der Wundheilung anzusprechen. Hier werden zwei verschiedene Methoden beschrieben, die verschiedene Aspekte der Wundheilungsreaktion behandeln. Im ersten Modell werden Polyvinylalkoholschwämme subkutan entlang des Mausdorsums implantiert. Nach dem Abruf von Schwämmen können Zellen durch mechanische Störungen isoliert werden, und Flüssigkeiten können durch Zentrifugation extrahiert werden, was eine detaillierte Charakterisierung der zellulären und zytokinen Reaktionen in der akuten Wundumgebung ermöglicht. Eine Einschränkung dieses Modells ist die Unfähigkeit, die Rate des Wundverschlusses zu beurteilen. Dazu wird ein Schwanzhautexzisionsmodell verwendet. Bei diesem Modell wird ein 10 mm x 3 mm rechteckiges Stück Schwanzhaut entlang der rückenden Oberfläche, in der Nähe der Basis des Schwanzes, ausgeschnitten. Dieses Modell kann leicht für die planimetrische Analyse fotografiert werden, um Heilungsraten zu bestimmen, und kann für histologische Analysen ausgeschnitten werden. Beide beschriebenen Methoden können in genetisch veränderten Mausstämmen oder in Verbindung mit Modellen von komorbiden Erkrankungen wie Diabetes, Alterung oder Sekundärinfektionen eingesetzt werden, um Wundheilungsmechanismen aufzuklären.
Introduction
Es gibt viele murine Modellsysteme zur Verfügung, um Wundheilungsprozesse zu untersuchen, die jeweils spezifische Vorteile und Einschränkungenbesitzen 1,2. Die folgenden Methoden stellen zwei murine Wundmodelle dar, von denen jedes einen bestimmten Aspekt der Wundheilungsreaktion behandelt und die verwendet werden können, um Ursache und Wirkung von Störungen in der Reaktion auf Verletzungen zu identifizieren. Der Prozess der Wundheilung findet in verschiedenen Phasen statt. Die erste Phase ist entzündlich, gekennzeichnet durch den schnellen Zustrom von Thrombozyten, Neutrophilen und Monozyten/Makrophagen, sowie die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen. Nach der Auflösung der Entzündung übergeht die Umgebung in einen reparativen Zustand mit der Induktion von profibrotischen und proangiogenen Zytokinen und Wachstumsfaktoren. Granulationsgewebe wird abgelagert und Neogefäße bilden sich mit der Migration von Myofibroblasten, Fibroblasten, Epithelzellen und Endothelzellen. In den letzten Stadien wird die provisorische extrazelluläre Matrix umgebaut, und Narbenbildung und Wundverschluss gehenweiter 2,3,4,5,6,7,8.
Kein einziges murines Modell bietet ein System, um alle Stadien der Wundheilung zu studieren2. Hier werden zwei chirurgische Wundmodelle beschrieben: Eines erläutert akute zelluläre und zytokine Wundheilungsreaktionen, das andere ermöglicht die Beurteilung des Wundverschlusses sowie histologische Analysen. Diese beiden Methoden können komplementär eingesetzt werden, um die Auswirkungen einer Störung oder Komorbidität auf verschiedene Aspekte der Wundheilungsreaktion zu bewerten. Die dorsale subkutane Implantation von Polyvinylalkoholschwämmen (PVA) ist ein System, das seit Jahrzehnten in Nagetiermodellen verwendet wird, um zahlreiche Aspekte der zellulären und Granulationsgewebereaktionen9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Dieser Ansatz ermöglicht die Rückgewinnung von zytokinreichen Wundflüssigkeiten und zellulären Infiltraten. Bei diesem Modell werden 1 cm x 1 cm x 0,5 cm PVA-Schwammstücke durch einen 2 cm Schnitt an der hinteren dorsalen Mittellinie in subkutane Taschen gelegt. Der Schnitt wird mit chirurgischen Clips geschlossen, und die Schwämme können zu späteren Zeitpunkten für die Zell- und Flüssigkeitsisolierung abgerufen werden. Das zelluläre und zytokinische Milieu isolierter Schwämme spiegelt die normalen Stadien der akuten Wundheilung bis etwa 14 Tage nach der Implantation wider. Zu späteren Zeitpunkten ist das Modell vorteilhafter für die Untersuchung der Granulationsgewebebildung und der Fremdkörperreaktion1. Mit diesem System ist es möglich, >106 Zellen zu isolieren, was einen deutlichen Vorteil für phänotypische und funktionelle Assays und RNA-Isolierung bietet, gegenüber der Isolierung von Zellen von anderen biopsiebasierten Methoden1,22,23,25,26.
Die Rate des Wundverschlusses wird anhand des Schwanzhautexzessionsmodells bestimmt. In diesem Modell, wie ursprünglich von Falanga et al. beschrieben und von anderen berichtet27,28,29,30, wird ein 1 cm x 0,3 cm voller Dicke Abschnitt der Schwanzhaut in der Nähe der Basis des Schwanzes entfernt. Der Wundbereich ist leicht zu visualisieren und kann im Laufe der Zeit gemessen werden. Alternativ kann Schwanzgewebe für die histologische Analyse isoliert werden. Dieser Ansatz kann als Alternative zur oder in Verbindung mit der etablierten Dorsal-Punch-Biopsiemethode verwendet werden. Die primären Unterscheidungen zwischen diesen beiden Modellen sind die Rate des Wundverschlusses, das Vorhandensein oder Fehlen von Fell und die Hautstruktur2,31,32. Schwanzhautwunden bieten einen längeren Zeitrahmen, um den Wundverschluss zu beurteilen, da es etwa 21 Tage dauert, bis eine Vollsperrung auftritt. Dies steht im Gegensatz zu unplinierten dorsalen Punschbiopsien, die viel schneller heilen (ca. 7–10 Tage), vor allem durch Kontraktion aufgrund der Wirkung des Panniculus carnosus. Splinted dorsal Punch Biopsien heilen langsamer und verringern die Auswirkungen der kontraktilen Heilung, aber verlassen Sie sich auf die Anwesenheit eines Fremdkörpers, kontraktile-basierte Mechanismen zu beschränken1,2,27,30,31,33.
Die beschriebenen Wundmodelle sind informativ, um normale Wundheilungsprozesse ohne Störung zu verstehen. Während sich die Heilung der Nagetierhaut in sehr signifikanter Weise von der menschlichen Haut unterscheidet, einschließlich loser Struktur, Abhängigkeit von kontraktiler Heilung und anderen anatomischen Unterschieden, bietet das murine System bestimmte Vorteile für mechanistische und Screening-Studien. Dazu gehören vor allem die Verfügbarkeit von inzuchtierten Stämmen und genetischen Mutanten, genetische Traktionsfähigkeit und niedrigere Kosten. Mechanistische Erkenntnisse aus murinen Studien können in komplexe Tiermodelle übersetzt werden, die die Heilung menschlicher Haut stärker nachahmen, wie das Schweinesystem2,31.
Zusätzlich zur Untersuchung der Wundheilungsreaktionen im stationären Zustand können diese Modelle mit komorbiden Bedingungen kombiniert werden, um die Grundlage von Wundheilungsdefekten auf Zell-, Zytokin- und Bruttogewebeebene zu verstehen. In diesem speziellen Umfeld können die beiden Modelle gemeinsam verwendet werden, um die Auswirkungen einer bestimmten komorbiden Erkrankung, wie z. B. einer postoperativen Lungenentzündung, sowohl auf die akute zelluläre Wundheilungsreaktion als auch auf die Rate des Wundverschlusses30zu bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel beschreibt zwei traktierbare murine Wundmodelle, die die Beurteilung der akuten Wundheilungsreaktion ermöglichen. Die erste Methode beinhaltet die chirurgische Implantation von PVA-Schwämmen im dorsalen subkutanen Raum. Dieser Ansatz bietet einen deutlichen Vorteil gegenüber biopsiebasierten Wundmodellen für die Untersuchung der zellulären Wundheilungsreaktion aufgrund der großen Anzahl von Zellen und der Menge an Wundflüssigkeiten, die aus den isolierten Schwämmen gewonnen werden. Für die erfolgr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Kevin Carlson von der Brown University Flow Cytometry and Sorting Facility für die Beratung und Unterstützung bei Flow Cytometry-Experimenten. Bilder in Abbildung 1B und C wurden mit BioRender erstellt. Kayla Lee und Gregory Serpa wird für ihre fotografische Unterstützung gedankt. Diese Arbeit wurde durch Stipendien von folgenden unterstützt: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean es Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, National Institute of Environmental Science (NIES) T32-ES7272 (Training in Environmental Pathology) und der Brown University Research Seed Award.
Materials
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 15 mL centrifuge tubes, Olympus | Genesee | 28-103 | |
| 1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| 5ml Syringe | BD | 309646 | |
| Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 | BioLegend | 109852 | Clone 104 |
| Anti-mouse F4/80-eFluor660 | ThermoFisher Scientific | 50-4801-82 | Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6C-FITC | BD Biosciences | 553104 | Clone AL-21 |
| Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 | ThermoFisher Scientific | 46-9668-82 | Clone 1A8-Ly6g |
| Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 | BD Biosciences | 565183 | Clone E50-2440 |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier | Braintree Scientific | NC9021392 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Blender Bag, 80mL | Fisher Scientific | 14258201 | |
| Culture Tube, 16mL, 17×100 | Genesee Scientific | 21-130 | |
| Fetal Bovine Serum – Standard | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Fixable Viability Dye eFluor506 | ThermoFisher Scientific | 65-0866-14 | |
| Hepes Solution, 1M | Genesee Scientific | 25-534 | |
| ImageJ Software | NIH | ||
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Polyvinyl alcohol sponge – large pore size | Ivalon/PVA Unlimited | www.sponge-pva.com | |
| Povidone-iodine solution, 10% | Fisher Scientific | 3955-16 | |
| Spray barrier film, Cavilon | 3M | 3346E | |
| Stomacher 80 Biomaster, 110V | Seward | 0080/000/AJ |
References
- Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8 (2), 83-96 (2000).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19 (4), 327-341 (2018).
- Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183 (5), 1352-1363 (2013).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2 (7), 327-347 (2013).
- Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10 (1), 650 (2019).
- Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362 (6417), 2971 (2018).
- Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100 (4), 1219-1227 (1985).
- Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (21), 7340-7344 (1985).
- Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102 (2), 300-305 (1987).
- Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48 (5), 460-463 (1990).
- Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165 (3), 262-267 (1999).
- Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (11), 1561-1563 (2005).
- Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14 (4), 443-452 (2006).
- Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156 (6), 1163-1171 (2007).
- Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28 (3), 278-283 (2007).
- MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 617-626 (2009).
- Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158 (1), 112-120 (2010).
- Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189 (5), 2563-2573 (2012).
- Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2 (2), 151-158 (2013).
- Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 59-67 (2010).
- Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174 (6), 2129-2136 (2009).
- Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21 (4), 624-633 (2013).
- Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174 (4), 2265-2272 (2005).
- Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9 (1), 86660 (2014).
- Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12 (3), 320-326 (2004).
- Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
- Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 468-477 (2019).
- Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14 (8), 1007212 (2018).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
- Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10 (2), 103-120 (2016).
- Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13 (6), 1299-1312 (2007).
- Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184 (7), 3964-3977 (2010).
- Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
- Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. , 1-4 (2014).
- Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175 (6), 2454-2462 (2010).
- DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101 (8), 1693-1698 (1998).
- Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 245-253 (2000).
- Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 318-339 (2015).
