後部皮下ポリビニルアルコールスポンジの移植と切除テール皮膚創傷モデルを用いた急性創傷治癒の評価
Summary
ここでは、2つのマウス創傷治癒モデルが記載されており、1つは細胞およびサイトカイン創傷治癒応答を評価するように設計され、もう1つは創傷閉鎖率を定量化するように設計されている。これらの方法は、糖尿病などの複雑な疾患モデルと共に使用して、創傷治癒不良の様々な側面のメカニズムを決定することができる。
Abstract
創傷治癒は、炎症、造粒組織形成、線維症、および分解能の整然とした進行を必要とする複雑なプロセスである。マウスモデルは、これらのプロセスに貴重な機械分析を提供します;しかし、創傷治癒応答のすべての側面に完全に対処する単一のモデルはありません。代わりに、創傷治癒のさまざまな側面に対処するために複数のモデルを使用することが理想的です。ここでは、創傷治癒応答の多様な側面に対処する2つの異なる方法について説明する。最初のモデルでは、ポリビニルアルコールスポンジはマウスのドーサムに沿って皮下に埋め込まれます。スポンジの取り出し後、細胞は機械的破壊によって単離され、液体は遠心分離によって抽出され、急性創傷環境における細胞およびサイトカイン応答の詳細な特徴付けが可能になる。このモデルの制限は、創傷閉鎖率を評価できないことです。このためには、テールスキン切除モデルが利用される。このモデルでは、尾の表面に沿って、尾の底部の近くに10 mm x 3 mmの長方形の尾の皮片が切除される。このモデルは、平面解析のために簡単に撮影して治癒率を決定し、組織学的分析のために切除することができます。両方の方法は、遺伝的に変化したマウス株、または、創傷治癒機構を解明するために、糖尿病、老化、または二次感染などの併存疾患のモデルと組み合わせて利用することができる。
Introduction
創傷治癒過程を調べるために利用できる多くのマウスモデルシステムがあり、それぞれが特定の利点と限界11、22を有する。以下の方法は、2つのマウス創傷モデルを提示し、それぞれが創傷治癒応答の特定の側面に対処し、傷害に対する応答における摂動の原因および影響を特定するために使用することができる。創傷治癒のプロセスは、明確な段階で起こる。第1段階は、血小板、好中球、および単球/マクロファージの急速な流入、ならびに炎症性サイトカインおよびケモカインの産生を特徴とする炎症性である。炎症の解決に続いて、環境は、前線維および前血管新生サイトカインおよび成長因子の誘導により、より修復的な状態に移行する。顆粒組織は、堆積し、新血管は、筋線維芽細胞、線維芽細胞、上皮細胞、および内皮細胞の移動と形成される。最終段階では、細胞外マトリックスが再モデル化され、瘢痕形成と創傷閉鎖が進行する2,,3,,4,,5,6,7,8.5
単一のマウスモデルは、創傷治癒2のすべての段階を研究するシステムを提供しない。ここでは、2つの外科的創傷モデルが記載されている:1つは急性細胞およびサイトカイン創傷治癒応答を解明し、もう1つは創傷閉鎖および組織学的分析の評価を可能にする。これら2つの方法は、創傷治癒応答の異なる側面に対する摂動または併存の影響を評価するために相補的な方法で採用され得る。ポリビニルアルコール(PVA)スポンジの皮下注入は、細胞および造粒組織応答の多くの側面を解明するために何十年もげっ歯類モデルで使用されてきたシステムである9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 、21,22,23,24.このアプローチはサイトカインが豊富な創傷液および細胞浸潤物の検索を可能にする。このモデルでは、PVAスポンジの1 cm x 1 cm x 0.5 cmの部分は後後の後方の正中線で作られた2cmの切開を通して皮下のポケットに置かれる。切開は外科用クリップで閉じられ、スポンジは細胞および液体の分離のための後の時点で取り出すことができる。分離されたスポンジの細胞およびサイトカインミリューは、着床後約14日までの急性創傷治癒の正常な段階を反映する。後の時点で、このモデルは造粒組織形成および異物応答1を研究する上でより有利である。このシステムを用いて、>106細胞を6 単離することが可能であり、これは表現型および機能的アッセイおよびRNA単離に対して明確な利点を提供し、他の生検ベースの方法11、22、23、25、2622,23から細胞を単離する上で。,25,26
創傷閉鎖率は、尾部皮膚切除モデルを用いて決定される。このモデルでは、最初にFalangaらによって記述され、他の人によって報告されたように27、28、29、30、,29,30尾の皮膚の1cm x 0.3 cmの完全な厚さのセクションは尾の基部の近くで除去される。27,創傷領域は容易に視覚化され、時間の経過とともに測定することができる。あるいは、尾部組織は組織学的解析のために単離され得る。このアプローチは、十分に確立された後部パンチ生検法に代わるものとして、または組み合わせて使用することができる。これら2つのモデルの主な違いは、創傷閉鎖率、毛皮の有無、および皮膚構造22、31、3231,32である。尾の皮膚の傷は、完全閉鎖が起こるのに約21日かかるため、創傷閉鎖を評価するためのより長い時間枠を提供する。これは、主にパンニクルカルノサスの作用による収縮によって、はるかに速く治癒する非スプラネートの後側パンチ生検に反対している。副生部の裏切りパンチ生検はよりゆっくりと治癒し、収縮治癒の影響を減少させるが、収縮ベースの,メカニズム1、2、27、30、31、332,27を制限するために異物の存在に依存する。,3330,311
記載された創傷モデルは摂動の不在の正常な創傷治癒過程を理解するための有益である。げっ歯類の皮膚の治癒は、緩い構造、収縮治癒への依存、およびその他の解剖学的な違いを含む人間の皮膚とは非常に重要な点で異なりますが、マウスシステムは、機械学的およびスクリーニング研究のための特定の利点を提供します。これらの中で最も重要なのは、近血種株および遺伝子変異体の入手可能性、遺伝的な難解性、および低コストである。マウス研究から得られた機械学的洞察は、ブタシステム22,3131のような人間の皮膚治癒をより密接に模倣する複雑な動物モデルに翻訳することができる。
定常状態における創傷治癒応答を調べることに加えて、これらのモデルは、細胞、サイトカインおよび総組織レベルにおける創傷治癒欠陥の基礎を理解するために、併存疾患と組み合わせることができる。この特定の設定では、2つのモデルを協調して使用して、術後肺炎などの特定の併存疾患の影響を評価し、急性細胞創傷治癒応答および創傷閉鎖率30の両方に及ぼす影響を評価することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、急性創傷治癒反応の評価を可能にする2つの難治性マウス創傷モデルについて説明する。最初の方法は、後部皮下空間におけるPVAスポンジの外科的移植を伴う。このアプローチは、単離されたスポンジから得られた多数の細胞および創傷液の量による細胞創傷治癒応答を研究するための生検ベースの創傷モデルに対して明確な利点を提供する。この処置を成功させるためには、…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ブラウン大学フローサイトメトリーとソーティング施設のケビン・カールソンに、フローサイトメトリー実験に関する協議と支援に感謝したいと考えています。図 1B と C のイメージは、BioRender を使用して作成されました。ケイラ・リーとグレゴリー・セルパは、彼らの写真の援助に感謝しています。この研究は、以下からの助成金によって支えられました:国防高等研究プロジェクト庁(DARPA)YFAA15 D15AP00100、新しい科学賞のディーンの領域(ブラウン大学)、国立心臓肺血液研究所(NHLBI)1R01HL126887-01A1、環境科学研究所(NIES)T32-ES7272(環境病理学の訓練)とブラウン大学研究シード賞
Materials
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 15 mL centrifuge tubes, Olympus | Genesee | 28-103 | |
| 1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| 5ml Syringe | BD | 309646 | |
| Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 | BioLegend | 109852 | Clone 104 |
| Anti-mouse F4/80-eFluor660 | ThermoFisher Scientific | 50-4801-82 | Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6C-FITC | BD Biosciences | 553104 | Clone AL-21 |
| Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 | ThermoFisher Scientific | 46-9668-82 | Clone 1A8-Ly6g |
| Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 | BD Biosciences | 565183 | Clone E50-2440 |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier | Braintree Scientific | NC9021392 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Blender Bag, 80mL | Fisher Scientific | 14258201 | |
| Culture Tube, 16mL, 17×100 | Genesee Scientific | 21-130 | |
| Fetal Bovine Serum – Standard | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Fixable Viability Dye eFluor506 | ThermoFisher Scientific | 65-0866-14 | |
| Hepes Solution, 1M | Genesee Scientific | 25-534 | |
| ImageJ Software | NIH | ||
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Polyvinyl alcohol sponge – large pore size | Ivalon/PVA Unlimited | www.sponge-pva.com | |
| Povidone-iodine solution, 10% | Fisher Scientific | 3955-16 | |
| Spray barrier film, Cavilon | 3M | 3346E | |
| Stomacher 80 Biomaster, 110V | Seward | 0080/000/AJ |
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