Avaliação da Cicatrização aguda de Feridas utilizando o Implante de Esponja de Álcool Subcutâneo Subcutâneo Dorsal e Modelos de Ferida de Cauda Excisional.

Summary

Aqui, dois modelos de cicatrização de feridas murinasão são descritos, um projetado para avaliar as respostas de cicatrização celular e citocina e o outro para quantificar a taxa de fechamento da ferida. Esses métodos podem ser usados com modelos de doenças complexas, como o diabetes, para determinar mecanismos de vários aspectos da má cicatrização de feridas.

Abstract

A cicatrização de feridas é um processo complexo que requer a progressão ordenada da inflamação, formação de tecido de granulação, fibrose e resolução. Os modelos murine fornecem uma valiosa visão mecanicista sobre esses processos; no entanto, nenhum modelo único aborda totalmente todos os aspectos da resposta de cicatrização de feridas. Em vez disso, é ideal usar vários modelos para abordar os diferentes aspectos da cicatrização de feridas. Aqui, dois métodos diferentes que abordam diversos aspectos da resposta à cicatrização de feridas são descritos. No primeiro modelo, esponjas de álcool polivinil são subcutâneamente implantadas ao longo do dorsum do rato. Após a recuperação da esponja, as células podem ser isoladas por ruptura mecânica, e os fluidos podem ser extraídos por centrifugação, permitindo assim uma caracterização detalhada das respostas celulares e citocinas no ambiente agudo da ferida. Uma limitação desse modelo é a incapacidade de avaliar a taxa de fechamento de feridas. Para isso, utiliza-se um modelo de excisão da pele da cauda. Neste modelo, um pedaço retangular de 10 mm x 3 mm da pele da cauda é excisado ao longo da superfície dorsal, perto da base da cauda. Este modelo pode ser facilmente fotografado para análise planimétrica para determinar as taxas de cura e pode ser extirparado para análise histológica. Ambos os métodos descritos podem ser utilizados em cepas de camundongos geneticamente alteradas, ou em conjunto com modelos de condições comórbidas, como diabetes, envelhecimento ou infecção secundária, a fim de elucidar mecanismos de cicatrização de feridas.

Introduction

Existem muitos sistemas de modelos murine disponíveis para examinar processos de cicatrização de feridas, cada um possuindo vantagens e limitações específicas^1,2. Os seguintes métodos apresentam dois modelos de ferida murina, cada um dos quais aborda um aspecto específico da resposta de cicatrização da ferida, e que podem ser usados para identificar a causa e o efeito das perturbações na resposta à lesão. O processo de cicatrização de feridas ocorre em fases distintas. A primeira fase é inflamatória, caracterizada pelo rápido fluxo de plaquetas, neutrófilos e monócitos/macrófagos, bem como pela produção de citocinas proinflamatórias e quimiocinas. Após a resolução da inflamação, o ambiente passa para um estado mais reparador com a indução de citocinas profibroticas e proangiogênicas e fatores de crescimento. O tecido de granulação é depositado e os neovasos se formam com a migração de miofibroblastos, fibroblastos, células epiteliais e células endoteliais. Nos estágios finais, a matriz extracelular provisória é remodelada, e a formação da cicatriz e o fechamento da ferida prosseguem^{2,3,4,5,6,7,8}.

Nenhum modelo de murina único fornece um sistema para estudar todos os estágios de cicatrização de feridas². Aqui, dois modelos de feridas cirúrgicas são descritos: um elucida respostas agudas de cicatrização celular e citocina, e o outro permite a avaliação do fechamento da ferida, bem como análises histológicas. Esses dois métodos podem ser empregados de forma complementar para avaliar os efeitos de uma perturbação ou comorbidade em diferentes aspectos da resposta à cicatrização de feridas. A implantação subcutânea dorsal de esponjas de álcool polivinilolito (PVA) é um sistema que tem sido usado em modelos de roedores há décadas para elucidar inúmeros aspectos das respostas do tecido celular e de granulação^{9,,10,,11,,12,,13,,14,15,,16,,17,18,19,20 ,21,,22,,23,,24}. Esta abordagem permite a recuperação de fluidos de feridas ricos em citocinas e infiltrações celulares. Neste modelo, 1 cm x 1 cm x 0,5 cm de esponja PVA são colocados em bolsos subcutâneos através de uma incisão de 2 cm feita na linha média dorsal posterior. A incisão é fechada com clipes cirúrgicos, e as esponjas podem ser recuperadas posteriormente para isolamento celular e fluido. O meio celular e citocina de esponjas isoladas reflete os estágios normais de cicatrização aguda da ferida até cerca de 14 dias após a implantação. Em pontos posteriores, o modelo é mais vantajoso para estudar a formação de tecidos de granulação e a resposta do corpo estranho¹. Com este sistema, é possível isolar >10⁶ células, o que oferece uma vantagem distinta para ensaios ofotinópicos e funcionais e isolamento de RNA, sobre células isoladas de outros métodos baseados em biópsia^{1,22,23,25,26}.

A taxa de fechamento da ferida é determinada usando o modelo de excisão da pele da cauda. Neste modelo, como descrito inicialmente por Falanga et al. e relatado por outros^27,28,29,30, uma seção de espessura total de 1 cm x 0,3 cm da pele da cauda é removida perto da base da cauda. A área da ferida é facilmente visualizada e pode ser medida ao longo do tempo. Alternativamente, o tecido da cauda pode ser isolado para análise histológica. Esta abordagem pode ser usada como uma alternativa ou em conjunto com o método bem estabelecido de biópsia de perfuração dorsal. As principais distinções entre esses dois modelos são a taxa de fechamento da ferida, a presença ou ausência de peles, e a estrutura da pele^2,31,32. As feridas da pele da cauda oferecem um prazo mais longo para avaliar o fechamento da ferida, pois leva aproximadamente 21 dias para que ocorra o fechamento total. Isso se opõe às biópsias de socos dorsais não desponadas, que cicatrizam muito mais rápido (~7-10 dias), principalmente por contração devido à ação do carnoso panniculus. As biópsias de perfuração dorsal estaladas curam-se mais lentamente e diminuem os efeitos da cicatrização contífica, mas dependem da presença de um corpo estranho para restringir os mecanismos de contração^{11,2,,27,,30,,31,33}.

Os modelos de feridas descritos são informativos para a compreensão dos processos normais de cicatrização de feridas na ausência de perturbação. Embora a cicatrização da pele de roedor difere de formas muito significativas da pele humana, incluindo estrutura solta, dependência da cura de contrações e outras diferenças anatômicas, o sistema murine oferece certas vantagens para estudos mecanicistas e de triagem. Entre eles está a disponibilidade de cepas de raça e mutantes genéticos, trabilidade genética e menor custo. A percepção mecanicista obtida a partir de estudos de murina pode ser traduzida em modelos animais complexos que imitam mais de perto a cicatrização da pele humana, como o sistema suíno^2,31.

Além de examinar as respostas de cicatrização de feridas no estado estável, esses modelos podem ser combinados com condições comórbidas para entender a base de defeitos de cicatrização de feridas no nível celular, citocina e tecido bruto. É neste cenário específico que os dois modelos podem ser utilizados em conjunto para avaliar os efeitos de uma determinada condição comórbida, como pneumonia pós-operatória, tanto na resposta aguda de cicatrização da ferida celular quanto na taxa de fechamento da ferida³⁰.

Protocol

Todos os estudos em animais descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso De Animais Institucionais da Universidade Brown e realizados de acordo com o Guia de Cuidado e Uso de Animais dos Institutos Nacionais de Saúde.  NOTA: no vídeo, a cortina cirúrgica foi omitida para fins de demonstração. 1. Implantação subcutânea de esponjas PVA Use uma tesoura para cortar folhas de esponja PVA em pedaços de 8 mm x 8 mm x 4 mm. Reidrate os pedaços de esponja PVA submer…

Representative Results

Resposta inflamatória sistêmica após implantação de esponja PVAA cirurgia de implantação da esponja PVA gerou uma resposta inflamatória sistêmica, como demonstrado pela indução de IL-6 no plasma 1 dia após a ferida(Figura 2A). Outras citocinas proinflamatórias, incluindo TNF-α e IL-1β, bem como uma série de quimiocinas, incluindo CCL2 e CXCL1, foram induzidas sistemicamente nos primeiros 7 dias após a implantação da esponja PVA, e foram descritas em ou…

Discussion

Este artigo descreve dois modelos de ferida murina tratável que permitem a avaliação da resposta aguda de cicatrização da ferida. O primeiro método envolve a implantação cirúrgica de esponjas PVA no espaço subcutâneo dorsal. Esta abordagem oferece uma vantagem distinta sobre os modelos de feridas baseadas em biópsia para estudar a resposta de cicatrização de feridas celulares devido ao grande número de células e quantidade de fluidos de ferida obtidos a partir das esponjas isoladas. Para a execução bem …

Materials

10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus	Genesee	28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red)	ThermoFisher Scientific	14025076
5ml Syringe	BD	309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750	BioLegend	109852	Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660	ThermoFisher Scientific	50-4801-82	Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC	BD Biosciences	553104	Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710	ThermoFisher Scientific	46-9668-82	Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700	BD Biosciences	565183	Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier	Braintree Scientific	NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm	Braintree Scientific	NC9334081
Blender Bag, 80mL	Fisher Scientific	14258201
Culture Tube, 16mL, 17×100	Genesee Scientific	21-130
Fetal Bovine Serum – Standard	ThermoFisher Scientific	10437028
Fixable Viability Dye eFluor506	ThermoFisher Scientific	65-0866-14
Hepes Solution, 1M	Genesee Scientific	25-534
ImageJ Software	NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15070-063
Polyvinyl alcohol sponge – large pore size	Ivalon/PVA Unlimited		www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10%	Fisher Scientific	3955-16
Spray barrier film, Cavilon	3M	3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V	Seward	0080/000/AJ