Vurdering av akutt sårheling ved hjelp av Dorsal Subkutan Polyvinyl Alkohol Svamp Implantation og Excisional Tail Skin Wound Modeller.

Summary

Her er to murine sårhelingmodeller beskrevet, en designet for å vurdere cellulære og cytokinsårhelingsresponser og den andre for å kvantifisere frekvensen av sårlukking. Disse metodene kan brukes med komplekse sykdomsmodeller som diabetes for å bestemme mekanismer ved ulike aspekter ved dårlig sårheling.

Abstract

Sårheling er en kompleks prosess som krever ryddig progresjon av betennelse, granulering vevdannelse, fibrose og oppløsning. Murine-modeller gir verdifull mekanistisk innsikt i disse prosessene; Imidlertid tar ingen enkelt modell fullt ut alle aspekter av sårhelingsresponsen. I stedet er det ideelt å bruke flere modeller for å adressere de forskjellige aspektene ved sårheling. Her beskrives to forskjellige metoder som tar for seg ulike aspekter ved sårhelingsresponsen. I den første modellen blir polyvinylalkoholsvamper subkutant implantert langs musens dorsum. Etter svampgjenfinning kan celler isoleres ved mekanisk forstyrrelse, og væsker kan ekstraheres ved sentrifugering, og dermed tillate en detaljert karakterisering av cellulære og cytokinresponser i det akutte sårmiljøet. En begrensning av denne modellen er manglende evne til å vurdere frekvensen av sårlukking. For dette benyttes en halehudeksisjonsmodell. I denne modellen blir et 10 mm x 3 mm rektangulært stykke halehud skåret langs dorsaloverflaten, nær bunnen av halen. Denne modellen kan enkelt fotograferes for planimetrisk analyse for å bestemme helbredende priser og kan bli utskåret for histologisk analyse. Begge beskrevne metoder kan brukes i genetisk endrede musestammer, eller i forbindelse med modeller av komorbide forhold, som diabetes, aldring eller sekundær infeksjon, for å belyse sårhelingsmekanismer.

Introduction

Det er mange murine modellsystemer tilgjengelig for å undersøke sårhelingprosesser, hver har spesifikke fordeler og begrensninger^1,2. Følgende metoder presenterer to murine sår modeller, som hver adresserer et bestemt aspekt av sårhelingsresponsen, og som kan brukes til å identifisere årsaken og effekten av perturbasjoner i responsen på skade. Prosessen med sårheling skjer i forskjellige faser. Den første fasen er inflammatorisk, preget av den raske tilstrømningen av blodplater, nøytrofiler og monocytter / makrofager, samt produksjon av proinflammatoriske cytokiner og chemokiner. Etter oppløsning av betennelse, miljøet overganger til en mer reparativ tilstand med induksjon av profibrotic og proangiogenic cytokiner og vekstfaktorer. Granulasjonsvev deponeres og neofartøy dannes med migrering av myofibroblaster, fibroblaster, epitelceller og endotelceller. I sluttfasen er den foreløpige ekstracellulære matrisen ombygd, og arrdannelse og sårlukking fortsetter^{2,,3,,4,,5,6,7,8}.

Ingen enkelt murine modell gir et system for å studere alle stadier av sårheling². Her beskrives to kirurgiske sårmodeller: en belyser akutt cellulær og cytokinsårhelingsrespons, og den andre åpner for vurdering av sårlukking samt histologiske analyser. Disse to metodene kan brukes på en komplementær måte for å vurdere effekten av en perturbasjon eller komorbiditet på ulike aspekter av sårhelingsresponsen. Den dorsal subkutan implantasjon av polyvinyl alkohol (PVA) svamper er et system som har blitt brukt i gnagermodeller i flere tiår for å belyse mange aspekter av cellulær og granulering vev^{responser 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24}. Denne tilnærmingen gjør det mulig å hente cytokinrike sårvæsker og cellulære infiltrater. I denne modellen plasseres 1 cm x 1 cm x 0,5 cm stykker PVA-svamp i subkutane lommer gjennom et 2 cm snitt laget på den bakre dorsal midtlinjen. Snittet er lukket med kirurgiske klipp, og svampene kan hentes på senere tidspunkt for celle- og væskeisolasjon. Cellulær og cytokinmiljø av isolerte svamper gjenspeiler de normale stadiene av akutt sårheling opptil ca 14 dager etter implantasjon. På senere tidspunkt er modellen mer fordelaktig for å studere granulering vevdannelse og fremmedlegemet respons¹. Med dette systemet er det mulig å isolere > 10⁶ celler, som gir en klar fordel for fenotypiske og funksjonelle analyser og RNA-isolasjon, over isolerende celler fra andre biopsibaserte metoder^{1,22,23,25,26}.

Frekvensen av sårlukking bestemmes ved hjelp av halen hud excision modell. I denne modellen, som opprinnelig beskrevet av Falanga et al. og rapportert av andre^27,28,29,30, en 1 cm x 0,3 cm full tykkelse delen av hale huden fjernes nær bunnen av halen. Sårområdet er lett visualisert og kan måles over tid. Alternativt kan halevev isoleres for histologisk analyse. Denne tilnærmingen kan brukes som et alternativ til eller i forbindelse med den veletablerte dorsal punch biopsimetoden. De primære forskjellene mellom disse to modellene er frekvensen av sårlukking, tilstedeværelse eller fravær av pels, og hudstrukturen^2,31,32. Hale hudsår tilbyr en lengre tidsramme for å vurdere sårlukking, da det tar ca 21 dager for full lukking å oppstå. Dette er i motsetning til unsplinted dorsal punch biopsier, som helbredemye raskere (~ 7-10 dager), hovedsakelig ved sammentrekning på grunn av virkningen av panniculus carnosus. Splinted dorsal punch biopsier helbrede saktere og redusere effekten av kontraktile healing, men stole på tilstedeværelsen av et fremmedlegeme for å begrense kontraktile-baserte mekanismer^{1,2,27,30,31,33}.

De beskrevne sårmodellene er informative for å forstå normale sårhelingsprosesser i fravær av perturbasjon. Mens helbredelsen av gnagerhud er forskjellig på svært betydelige måter fra menneskelig hud, inkludert løs struktur, avhengighet av kontraktile helbredelse og andre anatomiske forskjeller, tilbyr murine-systemet visse fordeler for mekanistiske og screeningstudier. Fremst blant disse er tilgjengeligheten av innavlede stammer og genetiske mutanter, genetisk tractability, og lavere kostnader. Mekanistisk innsikt oppnådd fra murine studier kan oversettes til komplekse dyremodeller som nærmere etterligner menneskelig hudhealing, for eksempel svinsystemet^2,31.

I tillegg til å undersøke sårhelingsresponser i steady state, kan disse modellene kombineres med komorbide forhold for å forstå grunnlaget for sårhelingsdefekter på cellulær, cytokin og brutto vevsnivå. Det er i denne spesielle innstillingen at de to modellene kan brukes til felles for å vurdere effekten av en bestemt komorbid tilstand, for eksempel postoperativ lungebetennelse, på både akutt cellulær sårhelingsrespons og frekvensen av sårlukking³⁰.

Protocol

Alle dyrestudier beskrevet her ble godkjent av Brown University Institutional Animal Care and Use Committee og utført i samsvar med Guide for care and use of Animals of the National Institutes of Health.  MERK: i videoen er den kirurgiske draperingen utelatt for demonstrasjonsformål. 1. Subkutan implantasjon av PVA svamper Bruk saks til å kutte ark med PVA svamp i 8 mm x 8 mm x 4 mm stykker. Rehydrere bitene av PVA svamp ved å senke dem i sterile 1x PBS i et beger. Aut…

Representative Results

Systemisk inflammatorisk respons etter PVA-svampimplantasjonPVA svamp implantasjon kirurgi generert en systemisk inflammatorisk respons, som demonstrert ved induksjon av IL-6 i plasma 1 dag etter såret (Figur 2A). Andre proinflammatoriske cytokiner, inkludert TNF-α og IL-1β, samt en rekke chemokiner, inkludert CCL2 og CXCL1, ble indusert systemisk i de første 7 dagene etter PVA svampimplantasjon, og har blitt beskrevet andre steder26,</su…

Discussion

Denne artikkelen beskriver to håndterbare murine sår modeller som tillater vurdering av akutt sårheling respons. Den første metoden innebærer kirurgisk implantasjon av PVA svamper i dorsal subkutan plass. Denne tilnærmingen gir en klar fordel over biopsibaserte sårmodeller for å studere cellulær sårhelingsrespons på grunn av det store antallet celler og mengde sårvæsker hentet fra de isolerte svampene. For vellykket utførelse av denne prosedyren, opprettholde et sterilt kirurgisk felt ved grundig rengjørin…

Materials

10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus	Genesee	28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red)	ThermoFisher Scientific	14025076
5ml Syringe	BD	309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750	BioLegend	109852	Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660	ThermoFisher Scientific	50-4801-82	Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC	BD Biosciences	553104	Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710	ThermoFisher Scientific	46-9668-82	Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700	BD Biosciences	565183	Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier	Braintree Scientific	NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm	Braintree Scientific	NC9334081
Blender Bag, 80mL	Fisher Scientific	14258201
Culture Tube, 16mL, 17×100	Genesee Scientific	21-130
Fetal Bovine Serum – Standard	ThermoFisher Scientific	10437028
Fixable Viability Dye eFluor506	ThermoFisher Scientific	65-0866-14
Hepes Solution, 1M	Genesee Scientific	25-534
ImageJ Software	NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15070-063
Polyvinyl alcohol sponge – large pore size	Ivalon/PVA Unlimited		www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10%	Fisher Scientific	3955-16
Spray barrier film, Cavilon	3M	3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V	Seward	0080/000/AJ