ヒト粘膜リンパ組織におけるEx Vivo自然免疫応答を研究する扁桃単核細胞の単核細胞の単離
Summary
本プロトコルでは、部分的な外科的扁桃摘出術を受けた健康なヒトから扁桃体単核細胞を容易に処理および培養し、活性化時に自然免疫応答を研究し、粘膜組織におけるウイルス感染を模倣する方法を説明する。
Abstract
粘膜関連リンパ組織(MALT)から単離された細胞を研究することは、組織における宿主病原体相互作用をモデル化することができるため、粘膜免疫を含む病理における免疫細胞応答の理解を可能にする。組織由来の単離細胞は最初の細胞培養モデルであったが、組織を得るのが難しいため、その使用は無視されてきた。本プロトコルでは、健康なヒト扁桃腺から扁桃体単核細胞(TMC)を容易に処理し培養し、活性化時に自然免疫応答を研究し、粘膜組織におけるウイルス感染を模倣する方法を説明する。扁桃腺は上皮をほとんど持たず、すべての主要な免疫細胞タイプの数十億まで生じるので、扁桃腺からのTMCの分離は速いです。この方法は、血液からの末梢単核細胞(PBMCs)の使用と同様に、免疫測定、qPCR、顕微鏡、フローサイトメトリーなどを含む複数の技術を用いてサイトカイン産生を検出することを可能にする。さらに、TMCは、将来の毒性アッセイのために考慮する必要があるPBMCよりも薬物検査に対する感度が高いことを示しています。したがって、ex vivo TMC培養は、簡単でアクセス可能な粘膜モデルです。
Introduction
人間の臓器に関する研究は、アクセシビリティだけでなく、明らかな倫理的理由のために制限されています。しかし、人間の生物学の複雑さを十分に理解するためには不可欠です。単離された細胞(一次培養または細胞株)の培養は、その利用可能性による細胞生物学研究における標準的なシステムである。単離された細胞培養は顕著な発見を可能にしたが、細胞株の使用は生体内器官生物学を完全に模倣していないため、より精査されている。しかしながら、三次元細胞または組織外植物の培養は、4、5、65,と非常に複雑である。実際、組織または器官の一部は、その細胞組成が組織の局在に応じて異なるため、非常に異種である。したがって、組織ブロックを使用するには、多くの技術的および生物学的複製の分析が必要であり、多数のドナーまたは患者の必要性につながります。
粘膜関連リンパ組織(MALT)は、構造的にはリンパ節に類似しているが、独特の機能を有するが、その主な役割は粘膜免疫を調節することであるため7。通常、組織からある程度の距離に位置するリンパ節とは異なり、MALTは一般的に粘膜組織の上皮のすぐ下に位置する。組織学的には、それらは主に高濃度のB細胞とT細胞で構成されているが、マクロファージや樹状細胞などの抗原提示細胞も含まれる。MALTは人体におけるリンパ組織の約50%を構成する。MALTは、GALT(腸-)、BALT(気管支-)、ナルト(鼻)、CALT(結膜)、LALT(喉頭-)、SALT(皮膚-)、VALT(vulvo-)、O-MALT(組織化)、D-MALT(拡散)の9つのグループに細分化される。O-MALTは、主にワルダイヤーの扁桃環の扁桃腺で構成され、最もアクセスしやすいMALT88、99です。実際、中咽頭に位置する扁桃腺は、(潜在的)侵襲性微生物10から消化管および気道を保護する主要な障壁を構成する。また、扁桃腺は、細かい層状扁平上皮非角化上皮で覆われ、血管、神経、およびリンパ管を含む結合組織のカプセルによって支持され、免疫細胞11、12,12への容易なアクセスを提供する。さらに、扁桃摘出術は、扁桃腺を除去する外科的行為であり、睡眠障害呼吸を有する小児に対して行われる一般的な処置であり、扁桃腺を生理学的な設定で容易に利用できる組織13にする。
扁桃腺は、粘膜免疫を伴う病理における免疫細胞応答の研究を可能にする。実際、HIV感染では、扁桃腺は高濃度の免疫細胞で構成されているため、それらはウイルス複製の主な標的であるが、また、循環14,15,15において検出されない大量のサイトカインを産生する。安定した状態では、先天性細胞のまれな集団は扁桃腺を含む様々な粘膜組織に存在するが、本質的に血液から存在しない。
したがって、扁桃腺(TMC)の単核細胞は、PBMCよりも関連性が高く複雑なモデルであり、より深い質問に答えることができます。一方、組織外植の使用は複雑であり、常に自然免疫研究に関連するとは限りません。そこで、TMCs16を用いて粘膜免疫活性化を研究する16モデルを確立した。ここでは、新鮮なヒト扁桃腺からTMCを効率的に分離する方法について述べています。この方法は、ex vivo研究のために完全性を保ちながら、多数の免疫細胞の回復を可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒト扁桃腺は、二次リンパ器官の役割を模倣するため、粘膜界面で自然免疫応答を研究するための統合的かつ生理的なex vivoモデルを表す。興味深いことに、TMCの細胞組成はPBMCに似ており、主要な細胞集団をすべて含んでいるが、その割合は血液からのPBMCとは異なる場合がある(図1)。すべての免疫応答は組織(粘膜または二次リンパ器官)で開始され、血液中ではなく、?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、アジェンス・ナショナル・ド・ラ・レシェルシュ・シュル・ル・シダ・エ・レ・ヘパティテスANRS(J-P.H)実験およびN.B.フェローシップ(AAP 2017 166)。N.S.は、ANRSによるフェローシップ(AAP 2016 1)、欧州分子生物学機構EMBOフェローシップ(LT 834 2017)、ウルム大学医学部のスタートアップ資金調達プログラム「バウシュタイン」(LSBN.0147)、ドイツフォルシュングスゲマイナンシャフトDFG(SM 544/1)からの支援を認めています。
Materials
| 10 meshes steel grid – 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid – 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin – to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
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