편도선 단핵 세포의 격리는 인간 점막 림프구 조직에서 Ex Vivo 타고난 면역 반응을 연구합니다
Summary
본 의정서에서는, 점막 조직에 있는 바이러스성 감염을 모방하고 활성화시 선천적인 면역 반응을 공부하기 위하여 부분적인 외과 편도선 절제술을 겪고 있는 건강한 인간에게서 편도선 단핵 세포를 쉽게 처리하고 배양하는 방법을 설명합니다.
Abstract
점막 관련 림프조직(MALT)에서 분리된 세포를 연구하면 조직에서 숙주 병원체 상호 작용을 모델링할 수 있기 때문에 점막 면역과 관련된 병리학에서 면역 세포 반응을 이해할 수 있습니다. 조직에서 유래된 분리된 세포는 첫번째 세포 배양 모형인 동안, 조직이 얻기 어려울 수 있기 때문에 그들의 사용은 무시되었습니다. 본 의정서에서는 건강한 인간 편도선으로부터 편도선 단핵세포(TMC)를 쉽게 처리하고 배양하여 활성화 시 선천적인 면역 반응을 연구하고 점막 조직의 바이러스 감염을 모방하는 방법을 설명합니다. 편도선에서 TMC의 격리는 빠르다, 편도선은 거의 어떤 상피를 가지고 모든 주요 면역 세포 유형의 수십억까지 항복하기 때문에. 이 방법은 혈액에서 말초 단핵 세포 (PBMC)의 사용과 유사한 면역 분석, qPCR, 현미경, 유동 세포 측정 등을 포함한 여러 기술을 사용하여 사이토카인 생산을 검출 할 수 있습니다. 또한, TMC는 미래의 독성 검사에 대해 고려해야 할 PBMC보다 약물 검사에 더 높은 민감성을 보여줍니다. 따라서, ex vivo TMC 문화는 쉽고 접근 가능한 점막 모델입니다.
Introduction
인간의 장기에 대한 연구는 접근성뿐만 아니라 명백한 윤리적 이유로 인해 제한됩니다. 그러나, 그(것)들은 인간 생물학의 복잡성을 완전히 이해하기 위하여 필수적입니다. 고립 된 세포의 배양 (1 차 배양 또는 세포주) 그들의 가용성 때문에 세포 생물학 연구에 표준 시스템. 고립 된 세포 배양은 뛰어난 발견을 허용했지만 생체 기관의 생물학에서 완전히 모방하지 않기 때문에 세포주를 사용하는 것은 면밀한 조사를 받고 있습니다. 그러나, 3차원 세포 또는 조직 이종의 배양은 매우4복잡4,5,,6이다. 실제로, 조직 이나 장기의 조각은 매우 이종성 때문에 그것의 세포 구성 조직에 국소화에 따라 다릅니다. 따라서 조직 블록을 사용하면 많은 기술적 및 생물학적 복제의 분석이 필요하며 많은 수의 기증자 또는 환자가 필요합니다.
점막 관련 림프조직(MALT)은 림프절과 구조적으로 유사하지만 점막 면역7을조절하는 것이 주된 역할이기 때문에 독특한 기능을 가지고 있다. 일반적으로 조직에서 어느 정도 떨어진 곳에 위치한 림프절과 달리, 몰트는 일반적으로 점막 조직의 상피 바로 아래에 위치합니다. 조직학적으로, 그들은 주로 B와 T 세포의 고농도로 구성되지만 대식세포 및 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포도 구성됩니다. 몰트는 인체에 있는 림프구 조직의 대략 50%를 구성합니다. 몰트는 그들의 위치에 따라 9개의 그룹으로 세분화됩니다: GALT (창자-), BALT (기관지-), NALT (비강), CALT (결막), LALT (후두), SALT (피부), VALT (불보-), O-MALT (조직), D-MALT (확산). O-MALT는 주로 Waldeyer의 편도선 링의 편도선으로 구성되어 있으며 가장 접근 하기 쉬운 MALT8,,9입니다. 실제로, 오로하린에 위치한 편도선은 (잠재적) 침습적미생물(10)으로부터소화 및 호흡기를 보호하는 주요 장벽을 구성한다. 또한 편도선은 혈관, 신경 및 림프를 포함하는 결합 조직의 캡슐에 의해 지원되는 미세 한 층상 편평상피비상각성 상피로 덮여 있어 면역세포(11,12)에12쉽게 접근할 수 있다. 또한 편도선 절제술은 편도선 제거의 수술로, 수면 장애 호흡을 가진 어린이에게 수행되는 일반적인 절차로, 편도선은 생리적 환경에서 쉽게 사용할 수 있는조직(13)입니다.
편도선은 점막 면역을 관련시키는 병리에서 면역 세포 반응의 연구를 허용합니다. 실제로, HIV 감염에서는 편도선이 고농도의 면역 세포로 구성되기 때문에 바이러스 복제의 주요 대상이지만순환(14,,15)에서검출되지 않는 다량의 사이토카인을 생성한다. 꾸준한 상태에서, 선천성 같이 세포의 희소한 인구는 편도선을 포함하여 각종 점막 조직에 존재합니다, 그러나 본질적으로 혈액에서 결석합니다.
따라서 편도선(TMC)의 단일 핵 세포는 PBMC보다 관련성이 높으며 복잡한 모델이며 더 심오한 질문에 답할 수 있습니다. 다른 한편으로는, 조직 이출의 사용은 복잡할 수 있고 항상 타고난 면역 연구 결과와 관련되지 않을 수 있습니다. 따라서, TMC16을사용하여 점막 면역 활성화를 연구하는 모델을 확립했다. 여기서는 신선한 인간 편도선에서 TMC를 효율적으로 격리하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 전 생체 내 연구에 대한 무결성을 유지하면서 많은 수의 면역 세포를 복구 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간 편도선은 점막 계면에서 타고난 면역 반응을 연구하기 위한 통합 및 생리학적 전 생체 모델을 나타내며, 이는 이차 림프구 기관의 역할을 모방하기 때문이다. 흥미롭게도, TMC의 세포 조성은 PBMC와 유사하며 혈액으로부터 PBMC와 다를 수 있지만 모든 주요 세포 집단을포함한다(도 1). 추가 인구는 또한 발견될 수 있습니다, 모든 면역 반응은 조직에서 시작되기 때문에 (점?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 기관 국립 드 라 Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P)에 의해 지원되었다. H) 실험 및 N.B. 펠로우십 (AAP 2017 166). N.S.는 동호회ANRS(AAP 2016 1), 유럽 분자생물학기구 EMBO(LT 834 2017), 울름대학교 의과대학 의학학부의 스타트업 자금 조달 프로그램 “바우스타인”, 도이치 포르스충스게마인샤프트 DFG(SM 544/1)의 지원을 인정합니다.
Materials
| 10 meshes steel grid – 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid – 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin – to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
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