Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Flow Cytometry Analyse av immuncelle undergrupper innenfor Murine Milten, Benmarg, Lymfeknuter og synovialvev i en slitasjegikt modell

Published: April 24, 2020 doi: 10.3791/61008
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Raymond Purves Bone and Joint Research Laboratory, Institute of Bone and Joint Research, Kolling Institute, Royal North Shore Hospital, University of Sydney, 2HTRG - Heidelberg Trauma Research Group, Center for Orthopedics, Trauma Surgery and Spinal Cord Injury, Trauma and Reconstructive Surgery, Heidelberg University Hospital, 3Department of Large Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Michigan State University

Summary

Her beskriver vi en detaljert og reproduserbar strømningscytometriprotokoll for å identifisere monocytt/makrofag og T-celleundergrupper ved hjelp av både ekstra- og intracellulære fargingsanalyser innenfor murinsplitten, benmargen, lymfeknuter og synovialvev, ved hjelp av en etablert kirurgisk modell av murinslitasjegikt.

Abstract

Artrose (OA) er en av de mest utbredte muskel- og skjelettsykdommene, som påvirker pasienter som lider av smerte og fysiske begrensninger. Nyere bevis indikerer en potensiell inflammatorisk komponent av sykdommen, med både T-celler og monocytter / makrofager potensielt forbundet med patogenesen av OA. Videre studier postulerte en viktig rolle for undergrupper av begge inflammatoriske celleavsnæringer, som Th1, Th2, Th17 og T-regulatoriske lymfocytter, og M1, M2, og synovium-vev-bosatt makrofager. Interaksjonen mellom den lokale synovial og systemisk inflammatorisk cellulær respons og de strukturelle endringene i leddet er imidlertid ukjent. For å fullt ut forstå hvordan T-celler og monocytter / makrofager bidrar mot OA, er det viktig å kunne kvantifisere disse cellene og deres undergrupper samtidig i synovialvev, sekundære lymfatiske organer og systemisk (milten og benmargen). I dag kan de forskjellige inflammatoriske celleundersettene identifiseres ved en kombinasjon av celleoverflatemarkører som gjør multi-fargeflytcytometri til en kraftig teknikk for å undersøke disse cellulære prosessene. I denne protokollen beskriver vi detaljerte trinn om høsting av synovialt vev og sekundære lymfatiske organer, samt generering av enkeltcellesuspensjoner. Videre presenterer vi både en ekstracellulær fargingsanalyse for å identifisere monocytter / makrofager og deres undergrupper, samt en ekstra- og intracellulær fargingsanalyse for å identifisere T-celler og deres undergrupper innenfor murinspleten, benmargen, lymfeknuter og synovialt vev. Hvert trinn i denne protokollen ble optimalisert og testet, noe som resulterte i en svært reproduserbar analyse som kan brukes til andre kirurgiske og ikke-kirurgiske OA-musemodeller.

Introduction

Artrose (OA) er en ødeleggende og smertefull sykdom som involverer ulike patologier i alle vev forbundet med ledd1. Påvirker ca 3,8% av den globalebefolkningen 2, OA er en av de mest utbredte muskel-skjelettsykdommer, og det er å bli den fjerde ledende årsaken tilfunksjonshemming over hele verden innen 20203. Posttraumatisk OA oppstår etter en leddskade og står for minst 12% av alle OA og opptil 25% av OA i mottakelige ledd som kneet4,5. Videre øker leddskaden livstidsrisikoen for OA med mer enn fem ganger6. Ikke alle skader med tilsynelatende lignende ustabilitet vil fortsette å utvikle OA, og derfor er det fortsatt utfordrende å definere faktorer som driver den langsiktige OA-risikoen. Det er avgjørende for å utvikle effektive behandlinger for å forebygge og/ eller behandle posttraumatisk OA, for å undersøke og bedre definere den skadespesifikke patologien, årsakene og mekanismene som predisponerer for OA1.

OA og dens definerende bruskødeleggelse ble tidligere tilskrevet helt og holdent til mekanisk stress, og dermed ble OA ansett som en ikke-inflammatorisk sykdom2. Nyere studier har imidlertid vist en inflammatorisk infiltrasjon av synovialmer og en økning av inflammatoriske celler i synovialvevet hos pasienter med OA sammenlignet med friske kontroller2, kaster lys over en inflammatorisk komponent som en potensiell drivkraft i OA. Videre studier indikerte at abnormiteter i både CD4 + og CD8 + T-celleprofil samt monocytter / makrofager i det medfødte immunsystemet kan bidra til patogenesen av OA2,7. Detaljerte undersøkelser av disse abnormitetene viste relevante roller for ulike T-celleundergrupper2, for eksempel Th18, Th29, Th178 og T regulatoriske (Treg)populasjoner 10,11. Til tross for dette overbevisende beviset er årsakssammenhenget mellom endringen av T-celleresponser og utviklingen og utviklingen av OA fortsatt ukjent2.

I tillegg til at spesifikke T-celler har en rolle i OA, tyder nyere studier på at differensialt polariserte /aktiverte makrofager kan være forbundet med patogenese av OA12. Spesielt akkumuleres makrofager som stammer fra blodmonocytter i synoviumet og polariserer til enten klassisk aktiverte makrofager (M1) eller alternativt aktiverte makrofager (M2) under OA-utvikling, noe som innebærer en sammenheng mellom monocyttavledede makrofager og OA13. I motsetning, visse undergrupper av makrofager fylle organer tidlig under utvikling og selvoppholde sine tall i en monocytt uavhengig sak14. Nylig ble en felles beskyttende funksjon mediert av en tett veikryssbarriere vist for disse synovial-vev-resident makrofager (STRMs)14. Disse funnene tyder på at abnormiteter spesielt makrofagsundersett kan spille en avgjørende rolle under utviklingen av OA. Interaksjonene mellom denne inflammatoriske cellulære responsen og de strukturelle endringene i leddet etter traumer er imidlertid ukjent.

Historisk sett var analyse av immunceller i synovialvevet begrenset til immunohistokjemi (IHC) eller mRNA-uttrykk ved omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (RT-PCR) nærmerseg 15,,16. Imidlertid mangler både IHC og RT-PCR muligheten til å identifisere flere forskjellige celletyper og deres undergrupper samtidig, og dermed begrense anvendeligheten til disse metodene. Videre er IHC begrenset til analyse av små prøver av vev og kan gå glipp av fokale inflammatoriske celleakkumuleringer. I løpet av de siste årene har en myriade av overflatemarkører for ulike celletyper blitt utviklet, og undergrupper av immunceller kan nå identifiseres pålitelig ved forskjellige kombinasjoner av disse markørene. På grunn av jevn teknisk fremgang er strømningssytometre nå i stand til å identifisere en rekke forskjellige fluorokromer samtidig som det muliggjør analyse av store flerfargede antistoffpaneler.

Flow cytometri gir etterforskerne en kraftig teknikk som tillater samtidig identifisering og kvantifisering av en rekke immunceller og deres undergrupper på enkeltcellenivå. Vi har utviklet og optimalisert både en ekstracellulær fargingsanalyse for å identifisere monocytter / makrofager og deres undergrupper, samt en ekstra / intracellulær fargingsanalyse for å identifisere T-celler og deres undergrupper innen murin milt, benmarg, lymfeknuter og synovialt vev. Hvert trinn i denne protokollen ble optimalisert og testet, noe som resulterte i en svært reproduserbar analyse som kan brukes til andre kirurgiske og ikke-kirurgiske OA-musemodeller17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Northern Sydney Local Health District Animal Ethics Committee har godkjent alle prosedyrer nevnt i denne protokollen. Mus er plassert og tatt vare på i samsvar med Guide for omsorg og bruk av laboratoriedyr (National Health and Medical Research Council of Australia Revidert 2010). For alle eksperimenter 10-12 uker gamle, mannlige C57BL/6 mus ble brukt.

MERK: For å indusere posttraumatisk OA ble kirurgisk destabilisering av den mediale menisken (DMM) i høyre kvelende ledd utført. Detaljert informasjon om denne dyremodellen ble publisert av Glasson et al.18. Kort sagt, generell anestesi induseres i et induksjonskammer ved hjelp av isofluran og deretter opprettholdes ved hjelp av en nesekjegle. Det kirurgiske benet er barbert med et barberblad og operasjonsstedet vaskes og vattpinnes med etanol for å minimere forurensning. Dyret flyttes deretter til operasjonsmikroskopet og plasseres på et sterilt håndkle og beinet drapert med sterilt papirdrap for å isolere operasjonsstedet og minimere forurensning. Ved hjelp av mikroskopet lages en 0,5 cm medial para-patella arthrotomy, patellaen luxated laterally, og infra-patella fettpute forhøyet for å avsløre medial menisco-tibial ligament, som transektes med dissekering tang. Leddet skylles med steril saltvann for å fjerne blod og såret er lukket i tre lag – leddkapsel, subkutant vev (ved hjelp av suturmateriale) og hud (ved hjelp av kirurgisk vevlim). Metoder som er beskrevet i denne protokollen, kan imidlertid brukes på andre modeller og metoder for å indusere OA. OA kan induseres i hver side av dyret, og når du høster vev, er det viktig å høste ipsilaterale (drenering) lymfeknuter.

1. Isolering av milten, kontralateral benmarg, ipsilaterale lymfeknuter som drenerer kvelende og synovialt vev

  1. Euthanize musen ved cervical forvridning. Plasser musen i en liggende stilling under et dissekerende mikroskop og tørk brystet, magen og bena med 70% etanol. Åpne forsiktig huden på midtlinjen for lengden av magen ved hjelp av rett saks som forlater bukhulen intakt.
  2. Trekk forsiktig huden på høyre side av dyret bort fra den underliggende muskelen og la det subkutane fettvevet festes til huden. Normalt vil mild trekkraft alene skille huden og underliggende fettvev fra muskelen. Sporadiske etterlevelser bør skjæres gjennom med fin saks for å holde spenningen som er nødvendig for å skille vev til et minimum og redusere sjansen for å skade lymfeknuter. Identifiser en kryssing av tre fartøy ved å forsiktig erte ut fettvevet som ligger på låret ved hjelp av to buede fine tang. Inngangslymfeknuten ligger ved krysset og kan identifiseres ved sin ovale form og litt mørkere farge.
  3. Fjern inngangslymfeknuten ved hjelp av fine dissekerings tang. Vær forsiktig så du ikke bryter kapselen. Fjern det gjenværende fettet på overflaten av lymfeknuten med tangene.
  4. Åpne bukhulen og identifiser milten. Klipp ut milten med fin saks. Trekk forsiktig tarmene til side for å utsette aorta og bifurcation være forsiktig med å skade dem, for å minimere risikoen for forurensning. Iliac lymfeknute ligger på terminalsegmentet av abdominal aorta og opprinnelsen til den vanlige iliac arterien. Fjern riktig iliac lymfeknute og fortsett som beskrevet i 1.3.
  5. Fjern forsiktig huden på begge baklemmer. Disseker venstre lårben ved å rense den fra muskelvev ved hjelp av bladet og fin saks. Koble forsiktig fra både kveler og hofteleddet og etterlot hele beinet intakt og fjern lårbenet.
  6. Identifiser patella senen i høyre kvelende ledd, og fjern deretter det tilstøtende muskelvevet proksimalt til dette ved hjelp av fin saks til ca 5 mm quadriceps sene proksimalt til patella er utsatt. Deretter skjærer du gjennom quadriceps-senen ca. 3-4 mm proksimalt til patella for å danne et håndtak og bruke fine pinsett, trekk den forsiktig bort fra leddet. Dette vil gjøre kantene på felleskapselen til lårbenet synlig, og ved hjelp av et skalpellblad forsiktig kuttet langs kantene av felleskapselen på begge sider, starter ved lårbenet går mot tibia, for å maksimere mengden synovialmembran som høstes. Mens du kutter er det viktig å opprettholde en mild trekkraft på quadriceps senen og pause når synovial vev blokken er bare festet til tibia. På dette stadiet er den intraartikulære fettputen nå tydelig synlig distal til patella og kan forsiktig løsnes fra leddet og fremre aspektet av menisci ved hjelp av bladet. Deretter skjæres langs den gjenværende delen av leddkapselen (tibialdelen) for å fjerne synovialvevsblokken.
    MERK: Dette trinnet må gjøres veldig presist for å gi pålitelige resultater. Etter å ha fullført disseksjonen, bør "synovial vevsblokken" bestå av patella, patella sene, infrarød fettpute, supra- og infrapatellar recesse synovial fôr og tilhørende felles kapsel fremre til sikkerhet leddbånd. Hold alle vev fuktig under disseksjon ved hjelp av 0,9% saltløsning.
    MERK: Plasser hver synovial vevsblokkprøve i en egen brønn av en merket 24-brønnsplate som inneholder 1,5 ml RPMI 1640 medium. Kombiner både iliac og inngangslymfeknuten i en brønn og bassengvev fra to mus.

2. Generering av enkeltcellesuspensjoner fra hvert vev

MERK: For å sikre tilstrekkelige celletall for strømningsanalyse må synovialvev fra to mus være samlet. I den nåværende protokollen, pool alle vev fra de samme to musene for å opprettholde analogi. Videre ble iliac og inguinal lymfeknuter kombinert for hvert dyr som resulterte i totalt 4 lymfeknuter for hver prøve. Generelt er celletall i milt, benmarg og lymfeknuter fra ett dyr tilstrekkelig til å gjennomføre strømningsanalyse og protokollen kan brukes. Men når du bruker vev fra bare ett dyr lysing ganger må justeres.

  1. Milten
    1. Plasser de to sammenslepne miltene på en 70 μm cellesil på toppen av et 15 ml rør. Macerate miltene forsiktig gjennom nettingfilteret med et sterilt 3 ml sprøytestempel. Skyll silen ofte med totalt 6 ml RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS.
    2. Spinn cellene (500 x g, 5 min, RT) og resuspend pellet i 5 ml rødblodcelle (RBC) lysis buffer. Inkuber i 5 min ved RT og stopp reaksjonen ved å fortynne lysisbufferen med 10 ml PBS. Spinn cellene (500 x g, 5 min, RT) og gjenta dette trinnet en eller til ikke mer RBC er i pellet.
      MERK: Refilter suspensjonen ved hjelp av en 30 μm cellesil i et nytt 15 ml rør mellom de to rundene med lysing for å fjerne koagulerte celler.
    3. Etter at lysingen er fullført, spinner cellene (500 x g, 5 min, RT), kast supernatant og resuspend pellet i 1 ml PBS. Telle antall levende celler på et hemocytometer ved hjelp av Trypan blå utelukkelse.
  2. Lymfeknuter
    1. Plasser de fire samlede lymfeknutene på en 70 μm cellesil på toppen av et 15 ml rør. Erte lymfeknutene forsiktig i en enkelt cellesuspensjon ved å trykke med et sterilt 3 ml sprøytestempel. Skyll silen ofte med totalt 6 ml RPMI med 10% FBS.
    2. Spinn cellene (500 x g, 5 min, RT), kast supernatant og gjenoppuss pelleten i 500 μL PBS. Refiltrer suspensjonen ved hjelp av en 30 μm cellesil i et nytt 15 ml rør for å fjerne koagulerte celler. Telle antall levende celler på et hemocytometer ved hjelp av Trypan blå utelukkelse.
  3. Benmargen
    1. Ta forsiktig tak i den intakte lårbenet ved hjelp av en vevstommelpinne uten å bryte den. Klipp av selve enden av den proksimale lårbenet med en skarp saks for å lette rødme av beinet. Snu lårbenet rundt og plasser en 23 G nål midt i det intercondylar hakket på lårbenet. Mens du bruker mildt trykk roterer nålen mellom tommel og pekefinger for å bore et hull i det intercondylar hakket for å komme inn i beinhulen.
      MERK: Noen ganger kan partikler av beinet hindre nålen etter boring av hullet, for å unngå unødvendig høyt trykk under spyling av en endring av nålen før spyling anbefales.
    2. Skyll beinet med 6 ml RPMI med 10 % FBS (eller til spylingen blir hvit) med en 10 ml sprøyte med en 23 G kanyle på en 70 μm cellesil som er plassert på et 15 ml rør. Trykk forsiktig benmargen gjennom cellesilen med et stempel på en 3 ml sprøyte og skyll silen med ytterligere 3 ml RPMI.
      MERK: Beinene skal være hvite når hele margen er helt spylt ut.
    3. Spinn cellene (500 x g, 5 min, RT) og resuspend pellet i 5 ml RBC lysis buffer. Inkuber i 5 min ved RT og stopp reaksjonen ved å fortynne lysisbufferen med 10 ml PBS.
    4. Spinn cellene (500 x g, 5 min, RT), kast supernatant og resuspend pellet i 1 ml PBS. Refiltrer suspensjonen ved hjelp av en 30 μm cellesil i et nytt 15 ml rør for å fjerne koagulerte celler. Telle antall levende celler på et hemocytometer ved hjelp av Trypan blå utelukkelse.
  4. Synovialvevet
    1. Terninger de to synovial vev blokker i små biter med en fin kirurgisk saks. Overfør prøvene med medium til et 15 ml rør. Skyll den gamle brønnen med ytterligere 0,5 ml RPMI for å få gjenværende celler og synovialvev, overfør til falkerør (endelig volum 2 ml).
      TIPS: Bruk en overføringspipette og kutt av spissen der diameteren utvides i dette trinnet.
    2. Rekonstituer enzymet og aliquot i henhold til produsentens instruksjoner (f.eks. Liberase). Tilsett tilstrekkelig enzym til å resultere i en endelig konsentrasjon på 1 enhet/ml (totalt 2 enheter per prøve). Digest ved 37 °C i 2 timer ved hjelp av en MACS rotator.
    3. Stopp fordøyelsen ved å legge til 8 ml RPMI med 10% FBS og filtercellesuspensjon gjennom en 70 μm cellesil i et nytt 15 ml rør. Skyll det gamle 15 ml røret med en annen 5 ml RPMI med 10% FCS medium og filter celle suspensjon gjennom samme celle sil inn i det nye røret (15 ml endelig volum).
    4. Spinn cellene (500 x g, 10 min, RT), kast supernatant og gjenoppuss pelleten i 500 μL PBS. Telle antall levende celler på et hemocytometer ved hjelp av Trypan blå utelukkelse.

3. Tildeling av celler

  1. Merk to 96-brønnsplater (U-bunnform) med type vev, dyre-ID og det angitte antistoffpanelet. Totalt brukes to antistoffpaneler i denne protokollen: Monocytt-undersettpanel (ekstracellulær farging) og T-celledelsettpanel (ekstra- og intracellulær farging).
  2. Gi 5 x 105 celler per brønn ved hjelp av de respektive enkeltcellesuspensjonene.
    MERK: Når du konfigurerer eksperimentet, bør du vurdere det absolutte antallet celler som forventes per gruppe- og vevstype (behandlede dyr har høyere celletall i vev enn kontrolldyr). Når du bruker cellepelleten på nytt i løpet av det siste trinnet med å generere enkeltcellesuspensjoner, velger du en passende mengde PBS for å ende opp med en konsentrasjon på 5 x 105 per 200 μL. Den 96-brønnsplaten som brukes her, kan inneholde maksimalt 300 μL, og vanligvis er 200 μL ideell for å minimere risikoen for krysskontaminering på grunn av søl.
  3. For hvert panel og vevstype, fordel minst 5 x 105 celler som uopphetede kontroller i brønner som er tydelig merket.

4. Monocytt delsett panel

  1. Utfør levedyktighetsfarging: Spinn celler (500 x g,5 min, 4 °C) ved hjelp av en platespinner og vask cellene én gang med 200 μL på 1x PBS. Forbered en lagerløsning av celle-impermeant aminreaktiv fargestoff (levedyktighetsflekk) fortynnet 1:50 i 1x PBS. Deretter bruker du cellepellets med 100 μL av denne lagerløsningen, noe som resulterer i et absolutt volum på 2 μL levedyktighetsflekk per brønn. Inkuber i 15 min ved 4 °C beskyttet mot lys.
    MERK: Den optimale mengden levedyktighetsflekk som trengs, bør bestemmes ved å utføre en dosetitreringskurve. I tillegg bør fortynnet levedyktighet flekk lagerløsning brukes på en enkelt dag og ikke lagres. Se produsentens instruksjoner for mer informasjon om hvordan du rekonstituerer, fortynner og lagrer levedyktighetsflekken.
  2. Under inkubasjonen, forberede cocktail av antistoffer i et passende volum av FACS buffer (Ca2 + og Mg + gratis PBS som inneholder 0,1% BSA og 0,02% natriumazid). Vask cellene to ganger med 200 μL FACS buffer, sentrifuge (500 x g, 5 min, 4 °C) og gjenoppuss hver pellet med 100 μL av antistoffblandingen eller passende kontrollblanding. Inkuber i 30 min ved 4 °C beskyttet mot lys.
    MERK: Vær oppmerksom på at natriumazid er giftig for celler. I den nåværende protokollen er konsentrasjonen av natriumazid i strømningsbufferen svært lav (0,02 %) og prøver kjøres umiddelbart etter farging dermed, ikke forårsaker noe problem. Hvis nedstrøms funksjonelle analyser av sorterte celler er planlagt, kan det være nyttig å gjøre opp fersk FACS buffer hver dag av eksperimenter og ikke bruke noen natriumazid. Når du bruker en rekke antistoffer, anbefales det å legge til en passende mengde "Brilliant Stain Buffer" til cocktailen av antistoffer for å forbedre resultatene.
  3. Vask cellene to ganger med 200 μL FACS-buffer og gjenoppuss cellene i 250 μL FACS + EDTA-buffer (FACS-buffer som inneholder 1 mM EDTA). Overfør prøver til merkede FACS-rør. Oppbevar prøvene ved 4 °C og beskyttet mot lys til anskaffelse.
    MERK: Immunceller har en tendens til å være klebrig. For å minimere både risikoen for blokkering og antall doble, anbefales det å legge til 1 mM EDTA i den endelige strømningsbufferen.

5. T Celle delsett panel

  1. Utfør levedyktighetsfarging: Spinn celler (500 x g,5 min, 4 °C) ved hjelp av en platespinner og vask cellene én gang med 200 μL på 1x PBS. Forbered en lagerløsning av celle-impermeant aminreaktiv fargestoff (levedyktighetsflekk) fortynnet 1:50 i 1x PBS. Deretter bruker du cellepellets med 100 μL av denne lagerløsningen, noe som resulterer i et absolutt volum på 2 μL levedyktighetsflekk per brønn. Inkuber i 15 min ved 4 °C beskyttet mot lys.
  2. Mens du inkuberer prøvene, må du tilberede den ekstracellulære fargestoffcocktailen i et passende volum på 1x FACS-buffer. Vask cellene to ganger med 200 μL 1x FACS buffer, spinn dem ned (500 x g,5 min, 4 °C) og gjenoppuss hver pellet med 100 μL av antistoffblandingen eller passende kontrollblanding. Inkuber i 30 min ved 4 °C beskyttet mot lys.
  3. Utfør den intracellulære fargingen med et fikserings- og permeabiliseringssett i henhold til produsentens instruksjoner. Vask cellene to ganger med 200 μL 1x FACS-buffer og gjenoppbruk i 200 μL fikseringsbuffer. Inkuber i 40 min ved 4 °C beskyttet mot lys.
  4. Under inkubasjonen, forberede cocktail av antistoffer (intracellulær farging) i et passende volum på 1x permeabilisering og vaskbuffer. Samle celler ved å spinne (750 x g,5 min, 4 °C) og vaske celler to ganger med 200 μL av 1x perm / vask buffer.
    MERK: Fiksering og permeabilisering resulterer i celler som pleier å være litt vanskeligere å riktig pellet. For å minimere celletap under de påfølgende vasketrinnene, øk sentrifugalkraften til 750 x g. Alternativt kan en lengre spinning syklus også brukes. Dette vil imidlertid resultere i en betydelig lengre tid som er nødvendig for å forberede cellene.
  5. Spinnceller (750 x g, 5 min, 4 °C) og gjenoppbruk hver pellet med 100 μL av antistoffblandingen eller passende kontrollblanding. Inkuber i 40 min ved 4 °C beskyttet mot lys.
  6. Vask cellene to ganger med 200 μL 1x perm/vaskebuffer og gjenoppuss cellene i 250 μL FACS + EDTA-buffer. Overfør prøver til merkede FACS-rør. Oppbevar prøvene ved 4 °C og beskyttet mot lys til anskaffelse.
    MERK: For hvert antistoff må den optimale konsentrasjonen bestemmes ved å utføre en dosetitreringskurve. Konsentrasjonen mellom antistoffer kan variere drastisk: CD3 og CD80 ble brukt med en fortynningsfaktor på 1:1, mens CD11b og CD4 ble brukt med en fortynningsfaktor på 1:6400. Ved titrering av antistoffkonsentrasjonen, bruk samme antall celler som skal brukes under forsøkene.

6. Kompensasjon, passende kontroller og gating

  1. Sette opp eksperimentet
    1. Når den optimale antistoffkonsentrasjonen er fastslått, er det ikke oppnådd noen få og enkle beisede kontroller for kompensasjon for å justere for spektral overlapping.
      MERK: Kjør alle kompensasjonskontroller med både celler og kompensasjonsperler. Bruk det som genererer de lyseste resultatene (høyeste MFI av positive hendelser) for kompensasjon. MFI står for gjennomsnittlig fluorescensintensitet og brukes ofte til å beskrive og definere gjennomsnittlig intensitet av det genererte signalet og dermed nivået av antistoffuttrykk.
    2. Kjør fluorescens minus en (FMO) kontroller og isotypekontroller når du starter et nytt flerfarget eksperiment. Ytterligere detaljer om FMO har tidligere blitt publisert19.
    3. Bestem den optimale FSC-A-spenningen (Forward Scatter Area) og SSC-A-spenningen (Side Scatter Area) for å oppdage leukocytterpopulasjonen i uopphetede kontroller av hver vevstype.
      MERK: Fikserings- og permeabiliseringsprosessen endrer dimensjonene på cellen. Dermed varierer FSC-A- og SSC-A-spenningene for Monocytt-delsettpanelet og T-celledelsettpanelet betydelig. For å finne de optimale spenningene for T Cell Subet Panel, bruk celler som har vært enkelt farget med CD3 og bakporten mot leukocytterpopulasjonene mens du justerer FSC-A- og SSC-A-verdiene.
  2. Gating strategi
    1. Når den optimale FSC-A og SSC-A spenningen er bestemt, sette opp en primær port på leukocytt befolkningen.
      MERK: Før hvert eksperiment kalibrerer cytometeret ved hjelp av kalibreringsperler i henhold til produsentens instruksjoner og kjør ustained perler. Leukocyttpopulasjoner av ulike tidspunkter bør ha sammenlignbare FSC- og SSC-egenskaper (små forskjeller mellom vevstyper forventes og normalt). Hvis FSC og SSC varierer betydelig problemer skyte cytometer og prøvegenerering.
    2. Ekskluder dobler: Plot FSC-A (y-akse) og FSC-H (x-akse). Singlets vises som en diagonal av dette plottet. Gate på singlets.
    3. Utelat død celle: Plot FVS510 (levedyktighet flekk) (x-akse) og FSC-A (y-akse). Døde celler vil vises som positive hendelser, og dermed gate på levende celler.
      MERK: Sanne negative celler vil være synlige i uopphetede kontroller. Juster dermed denne porten for hvert sett med prøver når du kjører de uopphetede kontrollene før beisede prøver. Videre gating avhenger av antistoffpanelet og celletypen som undersøkes. Gating strategier for hvert panel som brukes i denne protokollen kan bli funnet i henholdsvis figur 1 og figur 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representative resultater fra både monocyttdelpanel og T-celledelsettpanel er beskrevet nedenfor.

Figur 1 illustrerer den hierarkiske gating strategien for monocytt undergruppe panel på immunceller samlet fra benmarg av DMM behandlet dyr. Den samme strategien ble brukt og verifisert i alle andre vevstyper. Når du konfigurerer eksperimentet, ble spenningen Forward Scatter Area (FSC-A) og Side Scatter Area (SSC-A) bestemt for hver vevstype for å identifisere monocytter/makrofager og utelukke T-celler og rusk (G1). Under hvert eksperiment ble uopphetede kontroller av hver vevstype analysert, og FSC-A og SSC-A-spenning justerte når det var nødvendig. Spenninger forventes å forbli like over tid, hvis parametrene endres drastisk en blokkering av cytometeret er sannsynlig. Videre ble uopphetede kontroller brukt til å bestemme de sanne negativene for den døde / levende flekken og portene ble justert hver gang eksperimentet ble utført tilsvarende (figur 2A). Når du utformer eksperimentet, bør fluorokromer velges nøye, og normalt overflatemarkører med lavt uttrykk er forbundet med lyse fluorokromer (f.eks her Alexa Fluor 647 ble brukt for CD206). Ulike døde / levende flekker eksisterer som kan oppdages av forskjellige bølgelengder; her ble FVS510 brukt.

Figur 3 illustrerer prøvedata fra immunceller isolert fra synovialvev og farget med ekstracellulære overflatemarkører 6 uker etter at dyrene fikk enten DMM eller sham-control kirurgi. Alle undergrupper kan enkelt identifiseres ved hjelp av protokollen både i studier og kontroll dyr. Spesielt kan forskjeller mellom grupper ses for makrofagundersett (høyere prosentandel av Ly-6C+/MHC-II- makrofager (G7) i DMM-gruppen) og uttrykket for M1- og M2-makrofager (høyere prosentandel av M2-makrofager i DMM-gruppen).

Figur 4 visualiserer den hierarkiske gatingstrategien for det ekstra- og intracellulære T-cellepanelet på immunceller isolert fra milten av DMM behandlede dyr. Prinsippene er identiske med de som brukes for monocyttpanelet. Fikserings- og permeabiliseringsprosessen endrer imidlertid størrelsen og tettheten til celler. Dermed må typiske FSC- og SSC-parametere bestemmes ved hjelp av en back-gating-prosess fra CD3 + celler når du først konfigurerer eksperimentet for hver celletype. Noen fluorokromer har en tendens til å samle seg over tid (f.eks. PE som ble brukt med FoxP3 her). Aggregater kan potensielt endre resultatene på grunn av den høye lysstyrken som påvirker spektral overlapping og kompensasjon. Dermed ble alle antistoffer vortexed og spunnet ned hver gang før bruken for å redusere aggregater. I tillegg ble en gating strategi brukt til å ytterligere redusere påvirkningen av aggregater (G2). Under oppsett av forsøkene fluorescens minus en kontroller (FMOer) ble utført for hvert antistoff. Eksempeldata vises i figur 2B,2C.

Figur 5 og figur 6 viser immunceller som var isolert fra lymfeknuter ( figur5) og synovialt vev (figur 6) og farget ved hjelp av T-cellepanelprotokollen 4 uker etter at dyrene fikk enten DMM- eller sham-control kirurgi. Dataene viser en høyere prosentandel av Th1-celler hos DMM-dyr (G9) i begge vevene. Videre er intracellulær farging for T-regulatoriske celler (G11) og Th17 celler (G12) vellykket ved hjelp av protokollen og forskjeller kan oppdages mellom grupper.

Figure 1
Figur 1: Flytcytometri hierarkisk gating strategi ved hjelp av ekstracellulær farging for å identifisere monocytter / makrofager og deres undergrupper. Myeloid celler identifiseres hovedsakelig ved hjelp av en forover / side scatter (FSC-A og SSC-A) punktplott (G1). Deretter oppdages singleter ved hjelp av FSC-A og FSC-H (G2), og deretter velges levende celler (G3). Celler fra G3 klassifiseres videre ved hjelp av Ly-6G for å identifisere nøytrofiler (G4) og CD11b for monocytt/makrofager (G5a). MHC-II brukes til å identifisere dendrittiske celler (G5b) blant CD11b positive celler og F4/80 brukes til å velge mellom makrofager (G6) og monocytter (G12). Makrofager er videre klassifisert i sine undergrupper ved hjelp av Ly-6C og MHC-II (Ly-6C +/MHC-II- makrofager (G7); Ly-6C-/MHC-II- vev bosatt makrofager (G8); Ly-6C-/MHC-II+ blod oppsto makrofager (G9)). Flere delsett kan velges fra hele makrofager og de respektive delsettene ved hjelp av CD206 og CD80 (M1: CD80+/CD206- (G10); M2: CD80-/CD206+ (G11)). Monocytter klassifiseres videre ved hjelp av MHC-II og CD11c (MHC-II-/CD11c- monocytter (G13); MHC-II+/CD11c- monocytter (G14)). Aktiveringsnivået klassifiseres deretter ved hjelp av uttrykket Ly-6C og delt inn i lav (G15), medium (G16) og høy (G17). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eksempeldata som illustrerer passende kontroller i både monocytten og T-cellepanelet. Synovialvev ble høstet 6 uker etter enten DMM-kirurgi (DMM) eller sham-control-kirurgi (sham) og en enkeltcellesuspensjon ble farget ved hjelp av ekstracellulære overflatemarkører.A Under hvert eksperiment ble uopphetede celler brukt til å bestemme sanne negativer for den døde / levende flekken og for å sette porter (Kontroll). Innstilling av porter ved hjelp av uopphetede celler er vist i panel A. (B + C) Miltceller ble høstet fra ubehandlede kontrolldyr, en enkelt celle suspensjon generert og farget ved hjelp av både ekstra- og intracellulære markører. Fluorescerende-minus-en (FMO) kontroller ble generert av farging celler med hele antistoffpanelet mangler bare ett antistoff. Prøvedata vises for begge intracellulære antistoffer. (B) FMO -RORgt og (C) FMO -Fox-P3. FmOer ble utført for begge panelene og brukes til å sette hver port. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Ekstracellulær farging av monocytter/makrofager isolert fra synovium av mus. Prøvevev ble samlet inn 6 uker etter at mus fikk enten DMM-kirurgi (DMM) eller sham-control-kirurgi (sham). Ytterligere informasjon om de benyttede portene finner du i figur 1. Eksempeldata viser at alle delsett kan identifiseres pålitelig, og forskjeller kan ses mellom grupper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Flytcytometri hierarkisk gating strategi ved hjelp av både ekstra- og intracellulær farging for å identifisere T-celler og deres undergrupper. T-celler identifiseres hovedsakelig ved hjelp av en forover/side punktpunkt (FSC-A og SSC-A) punktplott (G1). På grunn av arten av de benyttede antistoffene, bør aggregater utelukkes ved bruk av CD3 og CD4 (G2). Deretter oppdages singleter ved hjelp av FSC-A og FSC-H (G3), og deretter velges levende celler (G4). Celler fra G4 klassifiseres videre ved hjelp av NK1.1 for å identifisere naturlige morderceller (G5) og CD3 for å identifisere T-celler (G6). Aktiveringsnivået bestemmes ved hjelp av CD69 (G6b). Deretter brukes CD4 og CD8 til å identifisere T-killer celler (CD4-/CD8+ (G7)) og T-helper celler (CD4 +/CD8- (G8)). T-helper celler er klassifisert i Th-1 (C-X-CR3 +/CCR4- (G9)) og Th-2 celler (C-X-CR3-/CCR4+ (G10)) ved hjelp av C-X-CR3 (CD183) og CCR4 (CD194). I tillegg identifiseres Th-17-celler (CD25+/RORgt+ (G11)) og T-regulatoriske celler (CD25+/Fox-P3+ (G12)) ved hjelp av intracellulære markører. Videre identifiseres minnecelleundersett fra T-hjelperceller ved hjelp av CD44 og CD62L (CD44-/CD62L+ naive T-minneceller (G13); CD44+/CD62L+ sentrale T-minneceller (G14); CD44+/CD62L- effektor T-minneceller (G15)). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Ekstracellulær og intracellulær farging av T-celler isolert fra drenering av lymfeknuter av mus. Prøvevev ble samlet inn 4 uker etter at mus fikk enten DMM-kirurgi (DMM) eller sham-control-kirurgi (sham). Ytterligere informasjon om de benyttede portene finner du i figur 4. Eksempeldata viser at alle delsett kan identifiseres pålitelig, og forskjeller kan ses mellom grupper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Ekstracellulær og intracellulær farging av T-celler isolert fra synovialt vev av mus. Prøvevev ble samlet inn 4 uker etter at mus fikk enten DMM-kirurgi (DMM) eller sham-control-kirurgi (sham). Ytterligere informasjon om de benyttede portene finner du i figur 4. Eksempeldata viser at alle delsett kan identifiseres pålitelig, og forskjeller kan ses mellom grupper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metodene som er beskrevet i denne protokollen er utformet og testet for å pålitelig identifisere ulike undergrupper fra både monocytter / makrofager og T-celler i murin milten, benmargen, lymfeknuter og synovialt vev i en murinmodell av slitasjegikt (OA). Den nåværende protokollen kan enkelt endres for å undersøke ulike vevstyper, eller andre celletyper ved å utveksle antistoffer, og kan brukes til alternative murine modeller av OA. Når du tester andre vevstyper, er det viktig å teste spesifisiteten til hvert antistoff som uttrykk for overflatemarkører av immunceller varierer i hvert vev20. I tillegg, når du utveksler antistoffer, er det nødvendig å utføre en dosetitreringskurve for å etablere den optimale konsentrasjonen av antistoff, samt gjenta kompensasjonsprosessen for å håndtere endringer i spektral overlapping.

I gjeldende protokoll ble OA indusert ved hjelp av DMM-musemodellen18. De mest brukte og etablerte dyremodellene er i musen, fordi denne arten gir flerfoldede fordeler ved å undersøke patofysiologien til posttraumatisk OA17. I musen spesielt, kirurgiske og ikke-kirurgiske OA modeller har blittbeskrevet 17: den vanligste er destabilisering av medial menisk (DMM), kirurgisk transeksjon av fremre korsbånd (ACLT) og ikke-kirurgisk ACL brudd (ACLR),henholdsvis 21. Alle disse dyremodellene er godt egnet for undersøkelse av rollen som cellulær betennelse i patologien til posttraumatisk OA, og den nåværende protokollen har blitt testet for alle tidligere nevnte dyremodeller i laboratoriet. Selv om alle de ovennevnte dyremodellene er etablert og har blitt beskrevet i litteraturen, har hver av dem sine egne styrker og begrensninger som har blitt diskutert i detaljandre steder 17 og så diskuteres bare kort nedenfor. Alle kirurgiske modeller er underlagt kirurgisk tilnærming, sårhelingsprosess og tilhørende inflammatorisk respons. Når man vurderer bidraget fra inflammatoriske celler til utviklingen av posttraumatisk OA, kan denne inflammatoriske sårhelingsresponsen tjene som konfounder, spesielt i de tidlige tidspunktene etter intervensjonen. I tillegg må DMM- og ACLT-prosedyrer utføres på en svært standardisert måte for å minimere variasjon mellom dyr. ACLT-operasjonen er mye vanskeligere å lære enn DMM-operasjonen og krever en større kirurgisk eksponering enn DMM for å definitivt identifisere og sikre skade bare til ACL og unngå iatrogen skade på andre leddvev18. Ikke-kirurgisk ACL-brudd er en standardisert og svært effektiv måte å indusere posttraumatisk OA på. Imidlertid er det nødvendig med en spesialisert enhet som bruker en kontrollert enkelt kompresjonsbelastning til tibia av det bøyde kneet. Denne enheten må kalibreres og testes for å få sammenlignbare og pålitelige resultater. I tillegg induserer ACLR-modellen svært alvorlig og progressiv leddskade hos mus med markert erosjon av det bakre mediale tibiale platået22 som ikke ses med ACL-skade hos andre arter, inkludert mennesker.

For å fullstendig karakterisere den inflammatoriske prosessen og dens cellulære komponent under utviklingen av OA, er det ønskelig å ikke bare undersøke synovialvevet, men også de lokale lymfeknuter samt sekundære lymfoide organer, som milten og benmargen. Lymfedrenasjemønstre i kneleddet har vært preget i mus og lymfevæske fra kneleddet avløp gjennom både iliac og inguinal lymfeknute ved varierendespredning 23,24. For å lette sammenlignbarheten mellom dyr, bestemte vi oss i denne protokollen for å pool inguinal og iliac lymfeknute. I motsetning, mens i nærheten av kneet, drenerer popliteal lymfeknute bakfoten og spiller ikke en rolle under inflammatoriske prosesser i kneet.

Mus har et lite volum intraartikulært synovialt vev25 og isolering av immuncellene her er fortsatt utfordrende. I den nåværende protokollen ble høstingsteknikker for synovialvev tilpasset for å tillate isolering av maksimalt antall immunceller. Derfor inkluderer høstingsteknikken supra- og infrapatellar-fordypningene samt infrapatellar kjepphestputen, på grunn av det høye antallet immunceller26. Fordøyelsesprosessen og valget av enzym ble optimalisert for å fullstendig fordøye synovialmembranen og fettvevet, samtidig som senen, og patellaen og brusken ble usvekket. Dermed introduserer den nåværende protokollen en reproduserbar metode for høsting av immunceller fra synovialt vev.

Flow cytometri analyse har flere fordeler ved utvisning av cellulære immunprosesser under utviklingen av OA; likevel har denne teknikken begrensninger. På grunn av det lille antallet immunceller i synovialvevet, er det nødvendig å samle vevsprøver fra minst to dyr for å få en prøve. På grunn av det store antallet fluorokromer og farger som brukes i denne protokollen, må spesiell oppmerksomhet rettes mot en omhyggelig kompensasjon av en mulig spektral overlapping for hver vevstype, og kompensasjon må evalueres konsekvent gjennom bruken av denne teknikken. På grunn av det store antallet tilgjengelige markører og betydelig variasjon blant studier for å identifisere en bestemt populasjon, er en annen mulig begrensning valget av markører som brukes til å identifisereceller 19. Flow cytometri tillater kvantifisering av "hendelser", som ikke nødvendigvis koordinerer til totale celler. For å oppnå en virkelig kvantitativ analyse, må man enten skaffe telleperler samtidig når man kjører flytanalyse eller telle celler i enkeltcellesuspensjoner på forhånd for å oppnå absolutte tall (som gjort her). Generelt kan prinsippene i denne protokollen (f.eks. hvordan man utformer og setter opp et strømningspanel eller teknikker som brukes til å forberede enkeltcellesuspensjoner) potensielt tilpasses for menneskelige prøver. Overflatemarkører av humane immunceller er imidlertid forskjellige fra murineceller, og derfor må passende antistoffer velges og testes. I tillegg må varigheten av RBC lysis og passende volum av buffer bestemmes da det mest sannsynlig er annerledes. Før tilpasning av metoder fra denne protokollen til andre arter eller vev er grundig testing av hvert trinn nødvendig for å sikre at metodene fungerer som de skal.

Til tross for begrensningene forblir strømningscytometrianalyse av immunceller en kraftig teknikk som gjør det mulig å identifisere både monocytiske celler og T-celleundersett på enkeltcellenivå. Spesielt introduserer den nåværende protokollen en pålitelig og reproduserbar teknikk som kan identifisere og kvantifisere cellulær immunrespons under utviklingen av OA i synovialvevet og sekundære lymfatiske organer. I fremtiden kan denne teknikken bidra til å karakterisere immunresponsen i ulike slitasjegikt induserende dyremodeller og deretter vurdere effekten av immunmodulerende legemidler på denne ødeleggende sykdommen.

Til slutt beskriver denne strømningscytometriprotokollen en detaljert og reproduserbar metode for å identifisere monocytter / makrofager og T-celleundersett ved hjelp av både ekstra- og intracellulære fargingsanalyser innen murinskrekt, benmarg, lymfeknuter og synovialvev ved hjelp av en etablert kirurgisk slitasjegiktmusemodell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Andrew Lim, Ph.D. og Giles Best, Ph.D. for deres hjelp til å sette opp flytcytometeret. Dette prosjektet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) tildelt PH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-mouse CD194 (CCR4) BioLegend 131212 T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst BD 566385 Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µg BD 564406 T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µg BD 564406 Monocyte Panel
Liberase, Research Grade Roche 5401127001 Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg BD 564985 Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg BD 562454 Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg BD 742274 T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg BD 565250 Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg BD 563061 T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg BD 557596 T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg BD 552775 T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg BD 565480 T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg BD 565261 T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg BD 740664 T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg BD 563687 Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg BD 563332 T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg BD 565411 Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg BD 560408 T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg BD 563414 Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg BD 560593 Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg BD 560600 Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg BD 564143 T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg BD 562894 T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing Buffer N/A N/A Buffers
Transcription Factor Buffer Set 100Tst BD 562574 Buffers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
  2. Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond. Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).
  3. Woolf, A. D., Pfleger, B. Burden of major musculoskeletal conditions. Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).
  4. Little, C. B., Hunter, D. J. Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials. Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).
  5. Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).
  6. Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).
  7. Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis. Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).
  8. Yamada, H., et al. Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints. Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).
  9. Sakkas, L. I., et al. T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis. Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).
  10. Guo, S. Y., et al. Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis. Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).
  11. Moradi, B., et al. CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood. Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97 (2014).
  12. Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).
  13. Zhang, H., et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).
  14. Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572, 670-675 (2019).
  15. Mocellin, S., et al. Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment. Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).
  16. Ward, J. M., et al. Immunohistochemical markers for the rodent immune system. Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).
  17. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).
  18. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  19. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  20. Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  21. Lorenz, J., Grassel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).
  22. Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
  23. Shi, J., et al. Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice. Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).
  24. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  25. Zhao, J., et al. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).
  26. Belluzzi, E., et al. Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain. BioMed Research International. 2019, 18 (2019).

Tags

Medisin Utgave 158 Slitasjegikt immunologi strømningscytometri lymfocytter undergrupper T-celler monocytter makrofager ortopedi posttraumatisk slitasjegikt
Flow Cytometry Analyse av immuncelle undergrupper innenfor Murine Milten, Benmarg, Lymfeknuter og synovialvev i en slitasjegikt modell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haubruck, P., Colbath, A. C., Liu,… More

Haubruck, P., Colbath, A. C., Liu, Y., Stoner, S., Shu, C., Little, C. B. Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model. J. Vis. Exp. (158), e61008, doi:10.3791/61008 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter