Summary
Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie das Pflanzenmaterial für die Immunlokalisierung von Arabinogalactan-Proteinen und Pektinen fixiert, in ein hydrophiles Acrylharz eingebettet, geschnitten und auf Glasrutschen montiert ist. Wir zeigen, dass zellwandbezogene Epitope mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden.
Abstract
Die Pflanzenentwicklung beinhaltet ständige Anpassungen der Zellwandzusammensetzung und -struktur als Reaktion auf innere und äußere Reize. Zellwände bestehen aus Zellulose und nicht-zellulosehaltigen Polysacchariden zusammen mit Proteinen, Phenolverbindungen und Wasser. 90% der Zellwand besteht aus Polysacchariden (z.B. Pektine) und Arabinogalactan-Proteinen (AGPs). Die fluoreszierende Immunlokalisierung spezifischer Glykanepitope in pflanzenhistologischen Abschnitten bleibt ein Schlüsselwerkzeug, um die Umgestaltung von Wandpolysaccharidnetzwerken, -strukturen und -komponenten aufzudecken.
Hier berichten wir über ein optimiertes fluoreszierendes Immunlokalisierungsverfahren zum Nachweis von Glykanepitopen aus AGPs und Pektinen in Pflanzengeweben. Paraformaldehyd/Glutaraldehyd-Fixierung wurde zusammen mit DER LR-White Einbettung der Pflanzenproben verwendet, was eine bessere Erhaltung der Gewebestruktur und -zusammensetzung ermöglicht. Dünne Abschnitte der mit einem Ultramikrotom erhaltenen eingebetteten Proben wurden zur Immunlokalisierung mit spezifischen Antikörpern verwendet. Diese Technik bietet eine großartige Auflösung, hohe Spezifität und die Möglichkeit, mehrere glykanische Epitope in der gleichen Probe zu erkennen. Diese Technik ermöglicht die subzelluläre Lokalisierung von Glykanen und erkennt deren Akkumulation in der Zellwand. Es ermöglicht auch die Bestimmung von räumlich-zeitlichen Mustern der AGP- und Pektinverteilung während entwicklungsischer Prozesse. Die Verwendung dieses Werkzeugs kann letztlich Forschungsrichtungen leiten und Glykane mit bestimmten Funktionen in Pflanzen verknüpfen. Darüber hinaus können die erhaltenen Informationen biochemische und Genexpressionsstudien ergänzen.
Introduction
Pflanzenzellwände sind komplexe Strukturen, die aus Polysacchariden und Glykoproteinen bestehen. Zellwände sind extrem dynamische Strukturen, deren Architektur, Organisation und Zusammensetzung je nach Zelltyp, Lokalisierung, Entwicklungsstadium, äußeren und inneren Reizen variieren1. Arabinogalactan Proteine (AGPs) und Pektine sind wichtige Bestandteile der Pflanzenzellwand. AGPs sind hochglykosylierte Proteine und Pektine sind homogalacturonanpolysaccharide, deren Zusammensetzung, Menge und Struktur in verschiedenen Pflanzenentwicklungsstadien stark variieren2,3,4. AGPs und Pektinstudien haben ihre Beteiligung an mehreren Pflanzenprozessen wie programmiertem Zelltod, Reaktion auf abiotische Belastungen, sexuelle Pflanzenreproduktion, unter vielen anderen5gezeigt. Die meisten dieser Studien begannen mit Informationen aus Immunlokalisierungsstudien.
Angesichts seiner Komplexität erfordert das Studium von Zellwänden viele verschiedene Werkzeuge. Der Nachweis von Glykinepitopen mit monoklonalen Antikörpern (mAbs) ist ein wertvoller Ansatz, um die Verteilung von Polysaccharid und Glykoprotein entlang dieser Struktur aufzulösen. Es gibt eine große Sammlung von mAbs zur Verfügung, um Glyglyan-Epitope zu erkennen und die Spezifität jedes mAb wird kontinuierlich verbessert sowie6. Die hier beschriebene Technik ist auf alle Pflanzenarten anwendbar und ist ein perfektes Werkzeug, um zukünftige Forschungsrichtungen zu leiten, die teurere und komplexere Techniken beinhalten könnten.
Bei dieser Technik werden spezifische Antikörper chemisch mit fluoreszierenden Farbstoffen wie FITC (Fluorescein isothiocyanat), TRITC (Tetramethylrhodamine-5-(und 6)-isothiocyanat) oder mehreren Alexa-Fluorfarbstoffen konjugiert. Die Immunfluoreszenz bietet mehrere Vorteile, die eine klare und schnelle subzelluläre Lokalisation von Glykanen ermöglichen, die direkt unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden können. Es ist sehr spezifisch und empfindlich, da die Herstellung der Probe effektiv die natürliche Struktur des Antigens schützen kann, auch wenn es in geringeren Mengen vorhanden ist. Es ermöglicht die Detektion von mehreren Antigenen in der gleichen Probe und am wichtigsten, bietet hohe Qualität und visuell schöne Ergebnisse. Trotz der großen Macht, die Fluoreszenz-Immunlokalisierungsstudien bieten, werden sie oft als schwierig durchzuführen und umzusetzen angesehen, höchstwahrscheinlich aufgrund des Fehlens detaillierter Protokolle, die die Visualisierung der verschiedenen Schritte des Verfahrens ermöglichen. Hier bieten wir einige einfache Richtlinien, wie diese Technik durchgeführt werden und wie man qualitativ hochwertige Bilder erhält.
Für das hier vorgestellte Protokoll müssen Die Proben zunächst mit dem am besten geeigneten Fixierungsprotokoll fixiert und eingebettet werden. Obwohl als zeitaufwändige und relativ mühsame Technik betrachtet, ist die richtige Fixierung und Einbettung der Pflanzenprobe der Schlüssel, um einen erfolgreichen Immunlokalisierungstest zu gewährleisten. Zu diesem Zweck ist die üblichste chemische Fixierung mit vernetzungsfixativen, wie Aldehyden. Vernetzungsfixative stellen chemische Bindungen zwischen Gewebemolekülen her, stabilisieren und verhärten die Probe. Formaldehyd und Glutaraldehyd sind vernetzungsfixative, und manchmal wird eine Mischung aus beiden Fixativen verwendet7. Formaldehyd bietet eine große strukturelle Konservierung von Geweben und über einen längeren Zeitraum, produziert kleine Geweberückzüge und ist mit der Immunfärbung kompatibel. Glutaraldehyd ist ein stärkeres und stabiles Fixativ, das in der Regel in Kombination mit Formaldehyd verwendet wird. Die Verwendung von Glutaraldehyd hat einige Nachteile, die berücksichtigt werden müssen, da es einige freie Aldehydgruppen in das feste Gewebe einführt, was zu einer unspezifischen Kennzeichnung führen kann. Auch die Vernetzung zwischen Proteinen und anderen Molekülen kann gelegentlich dazu führen, dass einige Zielepitope für die Antikörper unzugänglich werden. Um dies zu vermeiden, müssen Menge und Dauer der Fixierung sorgfältig definiert werden.
Nach der Fixierung werden die Proben in das richtige Harz eingebettet, um vor dem Erhalt der Abschnitte zu härten. London Resin (LR-White) Acrylharz ist das Harz der Wahl für Immunlokalisierungsstudien. Im Gegensatz zu anderen Harzen ist LR-White hydrophil, so dass die Antikörper ihre Antigene erreichen können, ohne dass eine Behandlung erforderlich ist, um es zu erleichtern. LR-White hat auch den Vorteil, eine geringe Autofluoreszenz zu bieten, was eine Reduzierung von Hintergrundgeräuschen während der Immunfluoreszenz-Bildgebung ermöglicht.
Es gibt viele Färbetechniken zur Verfügung, um verschiedene Komponenten der Zellwand zu erkennen, wie Alcian blaue Färbung, Toluidin blau Färbung oder Periodische Säure-Schiff (PAS) Färbung. Keines davon bietet die Kraft der Immunlokalisierungsanalysen8. Dieser Ansatz gibt eine größere Spezifität bei der Detektion von Glykanen und bietet umfangreichere Informationen über die Zusammensetzung und Struktur der Zellwand.
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Protocol
1. Probenvorbereitung: Fixierung, Dehydrierung und LR-White-Einbettung
- Fixierung und Austrocknung
HINWEIS: Der Fixierungsprozess ist wichtig, um die Probe zu erhalten. durch Vernetzung von Molekülen wird der Zellstoffwechsel gestoppt, wodurch die zelluläre Integrität gewährleistet und die molekulare Diffusion verhindert wird. Fixiermittel und die verwendete Konzentration müssen auf diesen Zweck angepasst werden, so dass die Antigene ausreichend exponiert sind, um mit den Antikörpern zu interagieren. Das folgende Protokoll kombiniert die milde fixative Fähigkeit von Paraformaldehyd mit der stärkeren Wirkung von Glutaraldehyd. Ihre Proportionen wurden für AGPs und Zellwandkomponenten optimiert, eignen sich aber auch für andere Proteine und Zellstrukturen. Der anschließende Dehydrierungsprozess bereitet die Proben für die LR-White Einbettung vor. In diesem Experiment wurden Pflanzengewebe verschiedener Pflanzenarten verwendet. Quercus suber Proben wurden von Bäumen gesammelt, die auf dem Feld angebaut wurden. Trithuria Tauchproben wurden freundlicherweise von Paula Rudall (Kew Gardens, London, UK) mit uns geteilt.- Säen Sie alle Arabidopsis-Pflanzen direkt auf dem Boden und wachsen Sie in einer Indoor-Wachstumsanlage mit 60% relativer Luftfeuchtigkeit und einem Tag-Nacht-Zyklus von 16 h Licht bei 21 °C und 8 h Dunkelheit bei 18 °C. Wählen Sie die zu analysierenden Pflanzengewebe aus, und trimmen Sie die Proben, die nicht mehr als 16 mm2 groß sind.
- Die Probe sofort in eine Glasdurchstechflasche übertragen, die zuvor mit genügend kaltfixativer Lösung (2% Formaldehyd (w/v), 2,5% Glutaraldehyd (w/v), 25 mM PIPES pH 7 und 0,001% Tween-20 (v/v)) gefüllt war, um die Proben vollständig unterWasser zu setzen (Abbildung 1A).
VORSICHT: Formaldehyd und Glutaraldehyd sind fixative Wirkstoffe, die durch Einatmen und Kontakt schädlich sein können. Führen Sie den Fixierungsschritt auf einer Dunstabzugshaube durch und tragen Sie angemessene Schutzkleidung und Nitrilhandschuhe. Alle Lösungen ab diesem Schritt, einschließlich Alkoholserien bis 70 %, sollten für eine spätere Dekontamination durch fachkundige Mitarbeiter gelagert werden. - Nachdem Sie alle Proben gesammelt haben, aktualisieren Sie das Fixativ.
- Übertragen Sie die Durchstechflaschen in eine Vakuumkammer, und wenden Sie langsam Vakuum auf. Bei Erreichen von -60 kPa beginnt das schwimmende Material auf den Boden der Durchstechflasche zu sinken (Abbildung 1B).
- Unter einem Vakuum von nicht mehr als -80 kPa für 2 h bei Raumtemperatur aufbewahren.
- Lösen Sie das Vakuum langsam los, versiegeln Sie die Glasdurchstechflasche und legen Sie sie über Nacht bei 4 °C ab.
- Verwerfen Sie alle Proben, die während der nächtlichen Fixierung nicht versanken. Waschen Sie die restlichen Proben mit 25 mM PBS pH 7 für 10 min, gefolgt von einer 20 min Waschen in 25 mM PIPES Puffer pH 7.2.
- Dehydrieren Sie die Proben in einer Ethanolserie (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90% und 3x 100% Ethanol) für jeweils 20 min. Übertragen Sie die dehydrierten Proben sofort auf beschriftete Glasfläschchen zum Einbetten (Abbildung 1C).
HINWEIS: Der Dehydrierungsprozess kann bei 70% Ethanol-Schritt angehalten werden.
- LR-White Harzeinbettung
HINWEIS: LR-white ist ein nicht hydrophobes Acrylharz mit geringer Viskosität, was es ideal für das Eindringen von Geweben mit vielen dicken Zellwandschichten macht. LR-White kommt auch in mehreren Härtegraden, die für das Schneiden der meisten Pflanzenproben kompatibel sind. Bitte stellen Sie sicher, dass das verwendete Harz bereits mit dem richtigen Katalysator geliefert wird, oder befolgen Sie die Anweisungen des Lieferanten, um das Harz vorzubereiten. Der folgende Einbettungsprozess ist langsam, aber die Ergebnisse rechtfertigen die Mittel erheblich.- Durchtrände die Proben durch Inkubation mit dem LR-Weißharz in einer Reihe von Halbmondkonzentrationen von Harz (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) in Ethanol, in jedem Schritt für 24 h bei 4 °C inkubierend.
VORSICHT: LR-White Harz ist ein Acrylharz mit geringer Toxizität; es kann jedoch durch Kontakt und Einatmen ein Reizmittel für die Haut sein. Arbeiten in einem gut belüfteten Bereich oder unter einer Dunstabzugshaube mit entsprechendem Schutzund und Nitrilhandschuhen ist sehr zu empfehlen. - Das LR-weiße Harz erfrischen und zusätzlich 12 h bei 4 °C brüten.
- Bereiten Sie geeignete Einbettungskapseln (Größe 1 (0,5 ml) für Proben bis 3 mm, 2 x 0,37 ml für Proben bis 5 mm oder 3 x 0,3 ml für Proben bis 8 mm und Papieretiketten(Abbildung 1D)vor.
HINWEIS: Wählen Sie die Kapselgröße aus, die etwas größer als die Probe sein soll, damit die Probe vollständig in das Harz eingeschlossen werden kann. Denken Sie auch daran, die Tags mit einem Bleistift zu beschriften, da Stift oder gedruckte Tinten das Harz verunreinigen und die Probe ruinieren. - Tragen Sie einen Tropfen frisches LR-weißes Harz auf den Boden jeder Kapsel auf.
- Legen Sie eine Probe in jede Gelatinekapsel und füllen Sie bis zur maximalen Kapazität mit frischem Harz. Legen Sie die Kapselkappe und drücken Sie vorsichtig, um eine hermetische Dichtung zu bilden (Abbildung 1E).
- Polymerisieren Sie das Harz für 24 bis 48 h bei 58 °C oder bis vollständig gehärtet.
- Proben bei Raumtemperatur lagern.
HINWEIS: Nach der Polymerisation LR-weiß Harz ist inert.
- Durchtrände die Proben durch Inkubation mit dem LR-Weißharz in einer Reihe von Halbmondkonzentrationen von Harz (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) in Ethanol, in jedem Schritt für 24 h bei 4 °C inkubierend.
2. Folienvorbereitung
HINWEIS: Glasschlitten müssen sauber und frei von Staub, Fett oder anderen Verunreinigungen sein. Auch neue Rutschen müssen gereinigt werden, da einige Lieferanten Öle und Reinigungsmittel verwenden, um zu verhindern, dass die Rutschen zusammenkleben. Jedes Fett oder Reinigungsmittel stört die Sektionshaftung am Schlitten, auch wenn es mit Poly-L-Lysin behandelt wird. Lint und Staub werden die Beobachtungen der Probe beeinflussen und das Experiment sehr wahrscheinlich ruinieren. Teflonbeschichtete Dias mit Reaktionsbrunnen sind perfekt für diese Aufgabe. Sie sind erschwinglich, wiederverwendbar und reduzieren die benötigte Antikörperlösung drastisch. Mit der richtigen Reinigung kann eine fluoreszierende Immunlokalisierung von hervorragender Qualität zu einem sehr erschwinglichen Preis durchgeführt werden.
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Rutschenwaschen
- Die Dias in ein Färbegestell legen und mit Reinigungslösung (0,1% SDS (w/v), 1% Essigsäure (v/v), 10% Ethanol (v/v)) abdecken.
- Halten Sie eine leichte Aufregung für 20 min.
- Die Färbestangen 10 min in ein ddH2O Bad mit leichter Rührung geben. Wiederholen Sie dies 4 Mal.
- Die Regale vor dem kurz eintauchen den Rack vorsichtig abtropfen lassen und die Dias in einer staubfreien Umgebung trocknen lassen.
- Speichern, bis sie verwendet werden.
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Poly-L-Lysin-Beschichtung (optional)
HINWEIS: Kleine Abschnitte kleben in der Regel sehr gut, um Glasschlitten zu reinigen. Dieser Schritt ist nur für größere Abschnitte empfehlenswert (>2 mm2). Größere Abschnitte neigen dazu, falten und Falten, und sind nicht ratsam. Dennoch, bei Bedarf verwenden Reaktionsschlitten mit größeren Löchern. Reinigen Sie sie wie oben und gehen Sie wie folgt vor.- Legen Sie saubere Dias in eine quadratische Petrischale. Pipette 0.001% Poly-L-Lysin Lösung (w/v) um die Löcher der Dias zu decken, ohne zu überlaufen.
- Lassen Sie die Rutschen über Nacht bei 40 °C in geschlossenen Petrischalen trocknen.
HINWEIS: Die beschichteten Schlitten sind sofort einsatzbereit und können mehrere Monate lang in einer staubfreien Umgebung bei Raumtemperatur gelagert werden.
3. Probenverschnitt und -schnitt
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Probenverkürzung
- Mit einer scharfen Rasierklinge, trimmen Sie die LR-White Blöcke unter einem Stereomikroskop, um eine pyramidenförmige Struktur zu bilden, wo die Spitze senkrecht zum Interessenbereich der Probe ist (Ergänzungsfigur 1A).
HINWEIS: Der Ultramikrotom-Probenhalter ist ein ausgezeichnetes Werkzeug, um den Block zu sichern. Wenn das Gerät keinen universellen Probenhalter hat, verwenden Sie den für runde Blöcke am besten geeigneten. - Trimmen Sie die pyramidenförmige Struktur, indem Sie feine Scheiben des überschüssigen Harzes senkrecht zur Pyramidenhauptachse entfernen.
- Fahren Sie fort, bis die Probe erreicht ist und die Schnittfläche gebildet wird. Innerhalb der Schnittfläche sollte die Zielprobe idealerweise in eine Trapezform eingeschlossen werden.
HINWEIS: Der Harzblock kann in einem Schlitzwinkel weiter getrimmt werden, um die Schnittoberfläche mit einer scharfen Klinge zu reduzieren (Abbildung 1F).
- Mit einer scharfen Rasierklinge, trimmen Sie die LR-White Blöcke unter einem Stereomikroskop, um eine pyramidenförmige Struktur zu bilden, wo die Spitze senkrecht zum Interessenbereich der Probe ist (Ergänzungsfigur 1A).
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Halbdünne Schnitte
HINWEIS: Es wird ein Mikrotom mit Glasmessern verwendet. Die Fähigkeit des Antikörpers, sich an das Epitop zu binden, bedingt den Erfolg der Immunlabeling-Reaktion. Die hydrophile Natur des LR-Whiteharzes ermöglicht einen guten Kontakt der Antikörper mit den Probenabschnitten. Dünnere Abschnitte präsentieren eine schwächere Calcofluor-Färbung, die verwendet wird, um die Abschnitte zu lokalisieren und beim Bildgebungsprozess zu helfen. Dasselbe gilt für andere Flecken, die später aufgetragen werden können. Auch übermäßige Dicke wirkt sich auf die Bildaufnahmequalität aus. Ein guter Kompromiss für die Schnittdicke kann zwischen 200 und 700 nm gefunden werden, abhängig von den Gewebeeigenschaften. Montieren Sie die Blöcke fest am Probenhalter des Ultramikrotomes.- Mit einem Ultramikrotom, machen Schnitte mit einer Dicke zwischen 200 und 700 nm (Abbildung 1G).
- Überprüfen Sie den Abschnittsbereich, indem Sie einige Abschnitte auf einen ddH2O-Tropfen auf einer Glasrutsche übertragen. Legen Sie die Rutsche auf eine 50 °C-Kochplatte, bis Wasser verdunstet. Stain, der einen Tropfen von 1% Toluidin Blue O (w/v) in 1% Borsäurelösung (w/v) über die Abschnitte für 30 s legt. Spülen und beobachten Unter dem Mikroskop.
- Wenn Sie die gewünschte Struktur finden, übertragen Sie einen oder zwei Abschnitte auf jeden Tropfen ddH2O, der zuvor auf jedem Brunnen eines sauberen Reaktionsschlittens platziert wurde.
- Jede Rutsche in eine geschlossene, saubere 10 cm quadratische Petrischale geben und bei 50 °C trocknen lassen.
- Speichern Sie Folien in einer sauberen Archivbox, bis sie verwendet werden.
4. Immunlokalisierung
HINWEIS: Das fluoreszierende Immunlokalisierungsverfahren beruht auf der sequenziellen Verwendung von zwei Antikörpern. Der primäre Antikörper wird gegen ein bestimmtes Zielantigen erhoben. Der sekundäre Antikörper wird speziell gegen den primären Antikörper angehoben und für fluoreszierende Techniken zu einem Fluorophor (FITC in diesem spezifischen Protokoll) konjugiert. Der primäre Antikörper wird verwendet, um das Zielantigen in der Probe zu erkennen, und der sekundäre Antikörper wird verwendet, um den Ort zu markieren, an dem der primäre Antikörper, der mit der Probe verbunden ist, nach dem Abwaschen des Überschusses an primärer Antikörper. Kontrollen sind ein wichtiger Teil dieses Testes und müssen immer durchgeführt werden, um die Genauigkeit der Beobachtungen zu gewährleisten. Ein Brunnen auf der Rutsche sollte für die Verwendung als Negativkontrolle reserviert werden, bei der die primäre Antikörperbehandlung übersprungen wird, und daher sollte am Ende des Experiments kein Signal beobachtet werden. Eine positive Kontrolle muss in das Experiment einbezogen werden, indem man gut mit einem Antikörper behandelt wird, dessen Kennzeichnung bereits bekannt und sicher ist. Die Positivkontrolle wird verwendet, um die Wirksamkeit der sekundären Antikörperkennzeichnung und Reaktionsbedingungen zu bestätigen, während die Negativkontrolle die sekundäre Antikörperspezifität testet.
- Bereiten Sie eine Inkubationskammer vor, indem Sie einige gedämpfte Papiertücher an der Unterseite einer Pipette-Spitzenbox platzieren und mit Zinnfolie umwickeln (Ergänzungsfigur 1B-1E). Platzieren Sie die Dias in der Inkubationskammer.
- Pipette eine 50 l L Tropfen pro 8 mm Gut der Blockierlösung (5% fettfreie Trockenmilch (w/v) in 1 M PBS) und inkubieren für 10 min. Entfernen Sie die Blockierlösung und waschen Sie alle Brunnen zweimal mit PBS für 10 min.
- Bereiten Sie die primären Antikörperlösungen vor (siehe Ergänzende Tabelle 1), 1:5 (v/v) Antikörper in der Blockierlösung; eine Schätzung von ca. 40 l pro 8 mm Brunnen vornehmen.
HINWEIS: Die Konzentration des Antikörpers muss gemäß dem Herstellungsprotokoll angepasst werden. - Führen Sie eine endende Wäsche mit ddH2O für 5 min, lassen Sie die Brunnen nie vollständig trocknen.
- Pipette die primäre Antikörperlösung zu den Reaktionsbrunnen. Pipettenblockierlösung für die Steuerbrunnen.
- Schließen Sie die Inkubationskammer und lassen Sie 2 h bei Raumtemperatur stehen, gefolgt von einer Übernachtung bei 4 °C. Bereiten Sie die sekundäre Antikörperlösung vor, 1% in der Blockierlösung (v/v) ca. 40 l pro Brunnen. Mit Zinnfolie bedeckt halten.
- Waschen Sie alle Brunnen zweimal mit PBS für 10 min, gefolgt von 10 zusätzlichen Minuten mit ddH2O. Stellen Sie sicher, dass keine Spur der Blockierlösung oder Ablagerungen auf den Brunnen sichtbar ist.
- Pipette die sekundäre Antikörperlösung für alle Brunnen. Schützen Sie die Dias von nun an vor Licht.
- Inkubieren Sie für 3-4 h im Dunkeln bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie alle Brunnen zweimal für 10 min mit PBS gefolgt von einer weiteren Wäsche von 10 min mit ddH2O.
- Tragen Sie einen Tropfen Calcofluor (1:10.000 (w/v) fluoreszierender heller 28 in PBS) auf jeden Brunnen auf. Ohne Waschen, einen Tropfen Montagemedium (siehe Materialtabelle) auf jeden Brunnen auftragen und einen Deckzettel platzieren (Abbildung 1H).
- Beobachten Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 und 100x/1.40 Linse ausgestattet ist, verwenden Sie UV (für Calcofluor-Färbung) und FITC-Filter, um Zellwand bzw. Immunlokalisierung zu erkennen (Abbildung 1I). Verwenden Sie die folgenden Wellenlängen: Anregung/Emission (nm) 358/461 für UV und 485/530 für FITC.
- Für eine bessere Visualisierung der Ergebnisse überlappen sich beide Bilder mit ImageJ oder ähnlichem.
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Representative Results
In einem erfolgreichen Experiment wird der sekundäre Antikörper die Position des spezifischen Epitops in hellem Grün in einer konsistenten Weise genau bestimmen, was die Charakterisierung der Zellwandzusammensetzung in einem bestimmten Entwicklungsstadium der Zelle, des Gewebes oder des Organs ermöglicht. Zum Beispiel hat der LM6-Antikörper eine hohe Affinität zu 1,5-Arabinan, einer Verbindung mit Typ-I-Rhamnogalacturonan, die reichlich gefunden werden kann, um die Zellwand des sich entwickelnden Quercus suber Anthers (Abbildung 2A)zu kennzeichnet, was den Schluss zulässt, dass diese Art von Pektin reichlich vorhanden ist und Teil der primären Zellwandzusammensetzung ist. JIM5 hat Affinität zu Homogalacturonanen, die kaum verestert sind und typischerweise an der Wurzelspitze des Quercus suber embryo npezifiziert sind, unter Angabe der mechanischen Eigenschaften des Organs (Abbildung 2B). Xylogalacturonan sind eine Art von Pektin reich an Xylose mit ZellwandLockerung verbunden, sie sind in degenerierenden Zellen gefunden. Der Antikörper LM8 erkennt speziell Xylogalacturonane, in reifenden Organen kann er verwendet werden, um degenerierende Zellen oder Gewebe zu detektieren, wie die Endospermzellen in den letzten Stadien der Quercus suber acorn reifung (Abbildung 2C).
JIM13 hat Affinität zu AGPs, die auf Strukturen gefunden wurden, die mit der Reproduktion zusammenhängen, Zelllinien im Zusammenhang mit der Mikrogametogenese in Arabidopsis thaliana (Abbildung 2D). JIM8 erkennt auch Epitope von AGPs, die in Zellen und Organen im Zusammenhang mit der Reproduktion vorhanden sind, wie die stigmatische Papille und Mikropyle der Basal Angiosperm Trithuria submersa (Abbildung 2E-2F). Beide Antikörper wurden als molekulare Marker für die gametophytischen Zelllinien in Pflanzen9vorgeschlagen.
Häufige Fehler in diesem Protokoll sind in der Regel leicht zu erkennen und zu identifizieren. Wenn die Wässen übersprungen oder die Reaktionsbrunnen trocknen gelassen werden, erscheint der sekundäre Antikörper in der Regel als unspezifischer Abstrich, der wahllos über Zellen, Gewebe, Harz und Dia bedeckt (Abbildung 3A). Aggregate von grünem Fluorchrom bilden sich, wenn der ungebundene Primärantikörper nicht richtig weggespült wurde (Abbildung 3B). Eine weitere häufige Ursache für das Versagen dieser Technik ist das Falten und/oder Lösen der Abschnitte (Abbildung 3C),wodurch das Experiment nutzlos wird. Dieses Problem hängt in der Regel mit entweder schlechter Haftung der Abschnitte auf den Dias zusammen, wahrscheinlich aufgrund der Verwendung von unsauberen Dias und/oder aggressivem Waschen.
Die Probenvorbereitung ist auch ein kritischer Schritt in diesem Verfahren. Glücklicherweise sind die häufigsten Fixierungs- und Einbettungsprobleme leicht zu erkennen (Abbildung 3D). Wenn alles gut geht, wird der Harzblock frei von Rissen sein und die Probe wird deutlich sichtbar mit einer hellgelben bis hellbraunen Farbe sein (Abbildung 3D-1). Ineffizient eingebettete Proben zeigen pulverförmige weiße Flecken oder Flächen (Abbildung 3D-2). Die Beibehaltung der Probengröße unter 8 mm ist wichtig, um das Eindringen der Fixierlösung zu gewährleisten. Wenn die Proben schlecht fixiert sind, erscheinen sie dunkelbraun fast schwarz(Abbildung 3D-3). Auch die Temperatur der Polymerisation ist sowohl für die Konservierung der Epitope als auch für die richtige Aushärtung des Harzes wichtig. Eine übermäßige Temperatur kann dazu führen, dass das Harz riss, was das Teilen der Probe unmöglich macht (Abbildung 3D-4).
Abbildung 1. Überblick über das gesamte Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Typische Ergebnisse von AGPs und Pectin-Immunlokalisierung in Pflanzenproben. (A) LM6-Kennzeichnung von arabinanmochen Pektinen in einem Quercus suber anther in meiose I. (B) Spezifische Kennzeichnung von niedrigen methylveresterten Pektinen in einer Quercus suber embryo wurzelspitze von JIM5. (C) Xylogalacturonan mit LM8 beschriftet im zurücktretenden Endosperm einer Quercus suber reifenden Eichel. (D) JIM13-Kennzeichnung von AGPs im Tapetum und Tetraden eines Arabidopsis thaliana Anthers. (E) AGPs, die von JIM8 in der stigmatischen Papille von Trithuria submersa. (F) JIM8-KennzeichnungagPs am Mikropyle (weißer Pfeil) einer Trithuria submersa ovule gekennzeichnet sind. Meiotische Mikrospore (Mc), Tapetum (Tp), Wurzel (R), Wurzelspitze (Rt), Testa (Ts), Endosperm (Ed), Embryo (Em), Epidermis (Ep), Stigmatische Papillen (SP), Ovule (OV). Maßstabsbalken: 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Häufige Fehler und Probleme während des Protokolls. (A) Versagen der Waschschritte wird durch das Vorhandensein eines unspezifischen Abstrichs von sekundärem Antikörper (+) über Probenharz festgestellt. (B) Die schlechte Spezifität oder das Waschversagen des Primärantikörpers führt zur Bildung von FITC-Aggregaten (+), die nicht an einen bestimmten Ort gebunden sind. (C) Falten und Abschnittsablösung sind oft das Ergebnis aggressiver Wäsche und unsauberer Rutschen. (D) Beispiele für Probenfixierung und Einbettung; (1) perfekte Probengröße und Einbettung, (2) Einbettungsfehler, (3) Probenfixierungsfehler, (4) Harzhärteversagen. FITC-beschrifteter Antikörper (grün) und Calcofluorweißer Fleck (blau). Maßstabsbalken: 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1. (A) Schematische Darstellung der Blockzuschneidungssequenz zur Vorbereitung der Probe (Gelber Block) für die Schnittung mit dem Ultramikrotom. Zunächst wird die Gelatinekapsel entfernt (1). Dann werden sie zunächst in einem Winkel von 40° bis 45° zu den Seiten der Kapsel tangential zur Probe (2) gestutzt, ein zweiter Schnitt wird bei 90° des ersten (3) gefolgt von einem dritten (4) und einem vierten nach der gleichen Regel (5) gemacht. Aus dieser ersten Phase des Trimmens ergibt sich eine pyramidenförmige Struktur, die sich über der Probe befindet. Schließlich wird der Gipfel mit einer scharfen Klinge senkrecht zur Harzblock-Hauptachse abrasiert, um die eingebettete Probe zu erreichen. Am Ende des Verfahrens sollte eine quadratische oder trapezförmige Oberfläche erhalten werden (6). (B) Erforderliche Vorräte für eine Inkubationskammer; Zinnfolie (1), doppelseitiges Klebeband (2), Papierhandtücher (3) und eine Pipettenspitzenbox. (C) Im ersten Schritt wird die Blechfolie mit dem doppelseitigen Klebeband an der Schachtel befestigt. (D) Im zweiten Schritt wird der Pipette-Spitzenhalter entfernt, um Papiertücher am unteren Rand der Box zu platzieren. (E) Im dritten Schritt werden die Papiertücher mit Wasser gedämpft und der Pipettespitzenhalter wird wieder zum Handeln mit einem Tablett für die Dias gebracht. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Liste der nützlichen monoklonalen Antikörper. Die obige Tabelle stellt ein Beispiel für verfügbare Antikörper dar, mit Informationen über ihre Ziele und wo sie gekauft werden können. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die hier beschriebene fluoreszierende Immunlokalisierungsmethode in Pflanzen, die zwar nahtlos unkompliziert ist, beruht jedoch auf dem Erfolg mehrerer kleiner Schritte. Die erste davon ist die Probenvorbereitung und -fixierung. In diesem ersten Schritt wird ein Gemisch aus Formaldehyd und Glutaraldehyd verwendet, um die Mehrheit der Zellkomponenten zu vernetzen. Das Formaldehyd in der Lösung sorgt für eine milde und reversible Fixierung, während das Glutaraldehyd eine starke dauerhaftere Verbindung bietet; das Gleichgewicht zwischen den beiden Fixativen bietet die entsprechende Menge an Vernetzung, so dass die Exposition der Epitope mit dem primären Antikörper10reagieren kann. Damit die Fixierlösung richtig funktioniert, muss die Probe klein sein. Große Strukturen mit einem Durchmesser von mehr als 7 mm sind sehr schwer zu befestigen und sollten abgeschnitten werden, um eine fixative Penetration zu gewährleisten.
Nach Verwundung oder Stress sezernieren einige Pflanzen große Mengen tannine, die dunkle Ausscheidungen bilden, die mit dem Formaldehyd reagieren können, das den fixativen Prozess stört. Die Proben auf Eis zu halten und die fixative Lösung zu ersetzen, wenn es bewölkt wird, hilft, diesen Effekt zu reduzieren. Luft kann auch den fixativen Prozess und später beim Einbetten und Härten des Harzes stören. Die vorgeschlagene Vakuumbehandlung sollte den größten Teil der Luft entfernen. Bei besonders luftigen Geweben kann der Vakuumschritt weiter als 2 h verlängert werden, bis keine Luft mehr aus den Proben kommt und sie nach unten sinken. Jede Probe, die nach dem über Nacht schwebenden Fixierungsschritt gefunden wurde, sollte verworfen werden. Die Harzeinbettung unterstützt das Schneiden der konservierten Probe, und ihre Härte sollte den eingebetteten Geweben10entsprechen. LR-White gibt es in drei Härtegraden: hart für holzige, stark sklerierte Gewebe, mittlerer Gehalt für die überwiegende Mehrheit der Gewebe von Blättern bis zu Pollenkörnern und weiche Qualität für empfindlichere Gewebe. Für eine perfekte Einbettung muss das Harz vollständig in die Probe eindringen; dies wird besser mit einer langsamen und allmählichen Infiltration erhalten. Bei vorherigen Tests können kürzere Inkubationszeiten verwendet werden. Die Gelatinekapseln sind sowohl klein als auch hermetisch verschließbar, was sie perfekt für die LR-White Harzhärtung macht. Bei einer Größe 2 (0,37 ml) sollte die Aushärtung nach 24 h bei 58 °C abgeschlossen sein. Bei anderen Kapselgrößen sollte die Aushärtungszeit angepasst werden. Das LR-White gehärtete Harz sollte von fast farblos zu einer hellen goldenen/BernsteinFarbe gehen und sich für die Nägel schwer anfühlen. Das Trimmen von Proben und die Verwendung des Ultramikrotom erfordert Übung, wird aber klare Zahlen liefern. Die Dicke und Größe des Abschnitts ist wichtig für die Bildgebung und Immunlokalisation Assay. Die Schnittdicke sollte um 500 nm gehalten werden. Abschnitte, die zu dünn sind, führen zu schlechter Färbung und Schnittstärken über 700 nm stören die Bildaufnahme und -auflösung. Die hydrophile Natur von LR-White Harz ermöglicht die direkte Verwendung der Abschnitte bei der Färbung und Immunlokalisierung, ohne das Harz zu entfernen.
Die Blockierlösung (5% fettfreie Trockenmilch in 1 M PBS) reduziert die unspezifische Bindung von Antikörpern. Fettfreie Trockenmilch ist eine zuverlässige Alternative zu BSA oder anderen traditionellen Blockiermitteln und deutlich kostengünstiger. Die Blockierlösung muss vor der Verwendung durch einen Papierfilter gefiltert werden, um Ausfällungen zu vermeiden, die schwer zu entwaschende Aggregate bilden, Antikörper aufbewahren und das Experiment gefährden. Die vorgeschlagenen Antikörperverhältnisse und Inkubationszeiten wurden optimiert und erfolgreich auf verschiedene Arten in mehreren Studienangewendet 9,11,12,13,14,15,16.
Verdunstung und Exposition an Licht sind zwei Probleme, die während des Immunlokalisierungsverfahrens vermieden werden müssen. Eine feuchte und dunkle Inkubationskammer löst beide Probleme. Ein Tutorial, wie man eine dunkle Kammer zu machen, finden Sie in Supplemental Figure 1B-1E. Dieses Immunlokalisierungsprotokoll fordert die Verwendung eines primären Antikörpers, der auf das Zielepitop ohne eigenes Etikett gerichtet ist, und eines sekundären Antikörpers, der mit einem Fluorchrom (FITC) konjugiert ist, der gegen den primären Antikörper IgG erhoben wird. Diese Methode bietet aufgrund einer erhöhten Stringenz des Nachweises mehrere Vorteile gegenüber der Verwendung eines einzigen Antikörperdetektionssystems, da der sekundäre Antikörper keine Affinität zur Zielprobenart hat. Dieses System bietet ein erhöhtes Signal, da die primären Antikörpermoleküle von mehreren Molekülen des sekundären Antikörpers angegriffen werden können, die jeweils ein Fluorchrom17tragen.
Der Zerfall von Fluorchromen durch intensives Licht oder Fotobleichen ist ein wichtiges Thema in dieser Technik. Vor allem bei der Erkundung von schwachen lokalisierten Signalen kann das Signal vor der Bildgebung irreversibel verloren gehen. Montagemedium erhöht die Stabilität und Lebensdauer der Fluorchrome18stark; es ist jedoch sehr ratsam, die Montagemedien zu testen, da einige mit dem Fleck und/oder dem Fluorchrom reagieren, Ausscheidungen bilden und das Bild verwischen. Die Konfiguration des optischen Systems zur Beobachtung und Registrierung der Immunlokalisierung ist einer der wichtigsten Aspekte für den Erfolg dieses Experiments. Aufgrund der reduzierten Dicke der Abschnitte sind die Vorteile des Konfokalmikroskops begrenzt. Die erfolgreichste Einrichtung erfordert ein herkömmliches aufrechtes Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer Fluoreszenzlichtquelle, LED- oder Quecksilber-Glühbirne19,mit ausreichenden Fluoreszenz-Grade-Objektiven ausgestattet ist. Auch hochwertige Lichtfilter für Anregung/Emission (nm) 358/461 für UV und 485/530 für FITC sind erforderlich. Für die Fluoreszenzbildaufnahme werden gekühlte monochromatische Digitalkameras aufgrund ihrer hohen Geschwindigkeit und Empfindlichkeit empfohlen, opfern aber echte Farbinformationen20. Polychromatische Kameras bieten die Möglichkeit, Signale aus Hintergrundfluoreszenz leicht zu sortieren, sind aber langsamer und weit weniger empfindlich als ihre monochromatischen Pendants.
Die Methode wird durch die Verfügbarkeit spezifischer Antikörper eingeschränkt. Trotz der Verfügbarkeit einer umfangreichen und wachsenden Sammlung von Antikörpern, die auf Pflanzenepitope ausgerichtet sind, sind verständlicherweise noch nicht alle pflanzlichen Verbindungen abgedeckt. Auch Lipide werden in der Regel durch die beschriebene Einbettungsmethode extrahiert und wird daher nicht für Gewebe mit hohem Ölgehalt empfohlen. Cryostat Abschnitt kann eine Alternative sein, trotz der Aufopferung der Bildauflösung. Die Temperatur der LR-White Harzpolymerisation kann in einigen Fällen empfindlichere Epitope verändern. Wenn das Zielepitop temperaturempfindlich ist, schalten Sie LR-White für LR-Goldharz. LR-Gold polymerisiert bei -25 °C unter weißem Licht und bietet eine hervorragende Konservierung der thermoempfindlichen Epitope, erfordert aber den Erwerb eines spezialisierten Polymerisationsgeräts und ist etwas giftiger als LR-White.
Diese Methode wurde in einer breiten Palette von Arten und Geweben verwendet. Es ermöglicht einen schnellen Zugriff auf zuverlässige Informationen über die spezifische Epitopverteilung. Bereitstellung von unterstützenden Daten für evolutionäre Modelle und identifizierung von Markern und spezifischen Anpassungen in Zellen und Geweben bei gleichzeitiger Bereitstellung visuell verlockender Ergebnisse. Die Verwendung von Antikörpern, die mit Fluorchromen über Peroxidase- oder alkalische Phosphatase-Konjugationsalternativen10konjugiert werden, ist weniger zeitaufwändig, deutlich weniger anfällig für Überreaktionsartefakte und bietet eine klare subzelluläre Auflösung, die mit jeder anderen Technik schwer zu halten ist. Die Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für zellwandbezogene Polymere sind, ermöglicht einen Einblick in die Anordnung von Verbindungen in sehr eingeschränkte Domänen. Eine solche Lösung wäre eine Herausforderung, die man aus traditionellen biochemischen Werkzeugen beziehen könnte. Das ständig wachsende Set primärer Antikörper bietet ständig neue Entdeckungsmöglichkeiten in der Pflanzenzelle.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Unterstützung erhielten die Autoren aus dem EU-Projekt 690946 "SexSeed" (Sexuelle Pflanzenreproduktion – Saatgutbildung), das von H2020-MSCA-RISE-2015 und SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017 gefördert wird. AMP erhielt ein Stipendium aus dem Projekt MSCA-IF-2016 der Europäischen Union (Nr. 753328). MC erhielt ein Stipendium aus dem FCT PhD-Stipendium SFRH/BD/111781/2015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Absolute ethanol | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size should fit the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| Vacuum chamber | na | na | |
| Vacuum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
References
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