فصل الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجياً، الببتيدات من المصادر الطبيعية والبروتينات من الميكروبات بواسطة طريقة التركيز الأيزوئي الإعدادي (IEF)
Summary
والهدف هو تجزئة وعزل الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا، والببتيدات من مستخلصات نباتية معقدة، والبروتينات من الميكروبات المسببة للأمراض عن طريق استخدام طريقة التركيز الأيزوفلوري (IEF) على مراحل السائل. وعلاوة على ذلك، تم تحديد الجزيئات المنفصلة وأكد نشاطها الحيوي.
Abstract
المنتجات الطبيعية المشتقة من النباتات والميكروبات هي مصدر غني للجزيئات النشطة بيولوجيا. قبل استخدامها، يجب تنقية الجزيئات النشطة من مستخلصات معقدة لتطبيقات المصب. هناك طرق كروماتوغرافية مختلفة متاحة لهذا الغرض حتى الآن لا يمكن لجميع المختبرات تحمل أساليب عالية الأداء والعزلة عن العينات البيولوجية المعقدة يمكن أن يكون من الصعب. هنا نثبت أن التركيز الايزويتريك للمرحلة السائلة (IEF) يمكن أن يفصل الجزيئات، بما في ذلك الجزيئات الصغيرة والببتيدات من مستخلصات نباتية معقدة، بناء على نقاطها الأيزوفلوريتية (pI). وقد استخدمنا هذه الطريقة في تجزئة العينات البيولوجية المعقدة وتوصيفها. كدليل على المفهوم، ونحن مجزأة استخراج مصنع Sylvestre Gymnema، وعزل عائلة من الجزيئات الصغيرة السابونين تيربينويد والببتيد. كما أظهرنا فصل البروتين الميكروبي الفعال باستخدام فطر المبيضات ألبيكان كنظام نموذجي.
Introduction
تنقية الجزيئات الحيوية من العينات البيولوجية المعقدة هي خطوة أساسية وصعبة في كثير من الأحيان في التجارب البيولوجية1. تركيز الأزوية (IEF) هو مناسب تماما لفصل عالية الدقة من الجزيئات الحيوية المعقدة حيث يسافر أمبيروليت الناقل وفقا لشحنتها وإنشاء التدرج درجة الH في مجال كهربائي3. تم تطوير أول ناقلة تجارية أمفوليت لـ IEF من قبل أولوف فيستربيرغ في عام 1964 وبراءة اختراع4،5. ampholytes الناقل هي أليفاتية ألتيجو أمينوية oligo-carboxylic حمض جزيئات متفاوتة الطول والمتفرعة6. في وقت لاحق، فيستربرغ وغيرها تحسين أمبيروليت الناقل لاستخدامها الموسع في فصل الجزيئات الحيوية6،7.
وتشمل أساليب فصل الجزيئات الحيوية agarose و polyacrylamide هلام الكهربائي، ثنائي الأبعاد هلام electrophoresis (2-DE)، تركيز isoelectric، الشعيرات الكهربائية، isotachophoresis وغيرها من تقنيات الكروماتوغرافي (على سبيل المثال، TLC، FPLC، HPLC)2. تم اختراع المرحلة السائلة IEF التي أجريت في أداة تسمى “Rotofor” من قبل ميلان بير8. وكان رائدا في مفهوم وتصميم هذه الأداة وساهم على نطاق واسع في نظرية الهجرة الكهربائية. كما طور فريقه نموذج رياضي لعملية الفصل الكهربائي للمحاكاة الحاسوبية9.
جهاز IEF في المرحلة السائلة هو خلية أسطوانية دوارة أفقيًا تتكون من نواة نايلون مقسمة إلى 20 مقصورة مسامية وقضيب سيراميك تبريد مياه متداول. تسمح الغرف المسامية للجزيئات بالهجرة عبر المرحلة مائي بين الأقطاب الكهربائية وتسمح بجمع العينات النقية تحت فراغ في الكسور. يمكن أن يوفر نظام التنقية هذا ما يصل إلى 1000 ضعف تنقية جزيء معين في < 4 ساعات. ومن السمات القيمة لهذا الصك هو أنه يمكن تطبيقه كخطوة أولى لتنقية من خليط معقد أو كخطوة نهائية لتحقيقنقاء 10. إذا كان جزيء الفائدة هو بروتين ، فإن ميزة أخرى هي أنه سيتم الحفاظ على تركيبها الأصلي أثناء الفصل.
وقد تم الإبلاغ عن استخدام السائل المرحلة IEF على نطاق واسع للبروتينات والإنزيمات وتنقية الأجسام المضادة6,10,11,12,13,14. هنا وصفنا استخدام هذا النهج لفصل وتنقية الجزيئات الصغيرة والببتيدات من النبات الطبي Gymnema sylvestre. سيساعد هذا البروتوكول الباحثين على تركيز وتنقية الجزيئات الصغيرة النشطة من مستخلص نباتي لتطبيقات المصب بتكلفة منخفضة. بالإضافة إلى ذلك، نبرهن أيضًا على أن إثراء البروتينات من مستخلص بروتين معقد من فطر المبيضات ألبيكان 15 في هذا النظام القائم على IEF كمثال ثان.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتشمل الجزيئات الصغيرة من مصادر المنتجات الطبيعية (مثل النباتات) نواتج مستقلبات ثانوية معقدة شديدة التنوع في التركيب الكيميائي. ويعتقد أنها تشارك في آليات الدفاع النباتية. وبالإضافة إلى ذلك، توجد أيضا في الأنسجة النباتية polypeptides22. هذه الجزيئات الصغيرة المنتج الطبيعي هي مصاد?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لمصادر التمويل من شعبة علم الأحياء ومركز جونسون لأبحاث السرطان لجوائز BRIEF و IRA ، على التوالي إلى GV. كما نشكر جائزة K-INBRE ما بعد الدكتوراه إلى RV. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل جائزة التنمية المؤسسية (IDeA) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم منحة P20 GM103418. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة أو المعاهد الوطنية للصحة. نشكر المراجعين المجهولين على تعليقاتهم المفيدة.
Materials
| 0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubator | Lab companion | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
| pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |
References
- Jankowska, U., et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).
- Pergande, M. R., Cologna, S. M. Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins. Proteomes. 5 (1), (2017).
- Stoyanov, A. IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution. Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).
- Vesterberg, O. A. Y. . Method of Isoelectric Fractionation. , (1964).
- Vesterberg, O., Svensson, H. Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins. Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).
- Righetti, P. G. . Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , 1 (1983).
- Vesterberg, O. Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes. Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).
- Bier, M. Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis. Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).
- Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation. Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).
- Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure. Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).
- Wagner, L., et al. Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization. Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).
- Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing. Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).
- Yu, J. J., et al. Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice. Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).
- Riyong, D., et al. Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).
- Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins. Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).
- Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d’Enfert, C. Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans. PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides. Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).
- Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre. Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).
- Craik, D. J. Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends. Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).
- Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif. Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).
- Stoecklin, W. Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).
- Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).
- Veerapandian, R., Vediyappan, G. Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms. Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).
- Chaffin, W. L. Candida albicans cell wall proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).
