Biyoaktif Küçük Moleküllerin, Peptidlerin Doğal Kaynaklardan ve Proteinlerden Preparatif İzoelektrik Odaklama (IEF) Yöntemi ile Mikroplardan Ayrılması
Summary
Amaç, sıvı fazlı izoelektrik odaklama (IEF) yöntemini çalıştırarak biyoaktif küçük molekülleri, kompleks bitki özünden peptitleri ve patojen mikroplardan proteinleri fraksiyonetmek ve izole etmektir. Ayrıca ayrılan moleküller tespit edildi ve biyoaktiviteleri doğrulandı.
Abstract
Bitkilerden ve mikroplardan elde edilen doğal ürünler zengin bir biyoaktif molekül kaynağıdır. Kullanımlarından önce, karmaşık ekstrelerden aktif moleküller downstream uygulamaları için saflaştırılmalıdır. Bu amaç için çeşitli kromatografik yöntemler mevcuttur ancak tüm laboratuvarlar yüksek performanslı yöntemler göze alamaz ve karmaşık biyolojik örneklerden izolasyon zor olabilir. Burada, preparatif sıvı fazizoelektrik odaklamanın (IEF) molekülleri, küçük moleküller ve peptidler de dahil olmak üzere karmaşık bitki özlerinden, izoelektrik noktalarına (pI) göre ayırabildiğimizi gösteriyoruz. Bu yöntemi karmaşık biyolojik numune fraksiyonu ve karakterizasyonu için kullandık. Kavramın bir kanıtı olarak, biz bir Gymnema sylvestre bitki ekstresi fraksiyone, terpenoid saponin küçük moleküller ve bir peptit bir aile izole. Ayrıca candida albicans mantarını model sistem olarak kullanarak etkili mikrobiyal protein ayrıştırma larını gösterdik.
Introduction
Biyomoleküllerin karmaşık biyolojik numunelerden arındırışı biyolojik deneylerde önemli ve çoğu zaman zor bir adımdır1. İzoelektrik odaklama (IEF), taşıyıcı amperatların yüklerine göre seyahat ettikleri ve bir elektrik alanında pH gradyanı nın oluşturuldukları karmaşık biyomoleküllerin yüksek çözünürlüklü ayrımı için uygundur3. IEF için ilk ticari taşıyıcı ampholyte Olof Vesterberg tarafından 1964 yılında geliştirilen ve patentli4,5. Taşıyıcı amperatlar alifatik oligo-amino oligo-karboksilik asit molekülleri değişen uzunluk ve dallanma6. Daha sonra, Vesterberg ve diğerleribiyomolekülleriayıran genişletilmiş kullanım için taşıyıcı ampholytes geliştirilmiş 6,7.
Biyomolekülleri ayırma yöntemleri arasında agarose ve poliakrilamid jel elektroforezi, iki boyutlu jel elektroforezi (2-DE), izoelektrik odaklama, kapiller elektroforez, izotachophorez ve diğer kromatografik teknikler (örn. TLC, FPLC, HPLC)2sayılabilir. “Rotofor” adı verilen bir enstrümanda gerçekleştirilen sıvı fazI IEF, Milan Bier8tarafından icat edilmiştir. Bu enstrümanın konseptine ve tasarımına öncülük etmiş ve elektroforetik göç teorisine büyük katkıda bulunmuştur. Ekibi ayrıca bilgisayar simülasyonları için elektroforetik ayırma sürecinin matematiksel bir model geliştirdi9.
Sıvı fazlı IEF aparatı, 20 gözenekli bölmeye bölünmüş bir naylon çekirdek ve sirkülasyon suyu soğutma seramik çubuktan oluşan yatay olarak dönen silindirik bir hücredir. Gözenekli bölmeler, moleküllerin elektrotlar arasındaki sulu fazdan geçmesine izin verir ve fraksiyonlarda vakum altında saflaştırılmış numunelerin toplanmasına izin verir. Bu arıtma sistemi,[lt;4 saat içinde belirli bir molekülün 1000 kata kadar saflaştırılmasını sağlayabilir. Bu aletin değerli bir özelliği, karmaşık bir karışımdan arınma için ilk adım olarak veya saflık10elde etmek için son bir adım olarak uygulanabilir olmasıdır. Eğer ilgi molekülü bir proteinise, bir diğer avantajı da ayrılma sırasında doğal konformasyonunun korunmasıdır.
Sıvı fazı IEF kullanımı proteinler, enzimler ve antikor saflaştırma6,10,11,,12,13,14için yaygın olarak bildirilmiştir. Burada tıbbi bitki Gymnema sylvestreküçük molekül ve peptidler ayıran ve arındırıcı için bu yaklaşımın kullanımını açıklar. Bu protokol, araştırmacıların düşük maliyetle aşağı akım uygulamaları için bir bitki özü aktif küçük molekülleri konsantre ve arındırmak yardımcı olacaktır. Buna ek olarak, bu IEF tabanlı sistemde Candida albicans mantar15 karmaşık bir protein ekstresinden proteinlerin zenginleştirme ikinci bir örnek olarak göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Doğal ürün kaynaklarından (örneğin, bitkiler) gelen küçük moleküller, kimyasal yapı olarak oldukça çeşitli karmaşık ikincil metabolitleri içerir. Onlar bitki savunma mekanizmaları dahil olduğuna inanılmaktadır. Buna ek olarak, polipeptidler de bitki dokularında mevcuttur22. Bu doğal ürün küçük moleküller ilaç keşif ve geliştirme için test moleküllerinin zengin kaynaklarıdır. Ancak, izolasyon ve arınma için gerekli zor ve sıkıcı yöntemler terapötik uygulam…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Biyoloji Bölümü ve Johnson Kanser Araştırma Merkezi BRIEF ve IRA ödülleri için, sırasıyla GV için finansman kaynakları için müteşekkiriz. Ayrıca RV için K-INBRE doktora sonrası ödül teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen P20 GM103418 hibe numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü’nden Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA) tarafından desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü’nün veya Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Biz yararlı yorumlar için anonim yorumcular teşekkür ederiz.
Materials
| 0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubator | Lab companion | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
| pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |
References
- Jankowska, U., et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).
- Pergande, M. R., Cologna, S. M. Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins. Proteomes. 5 (1), (2017).
- Stoyanov, A. IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution. Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).
- Vesterberg, O. A. Y. . Method of Isoelectric Fractionation. , (1964).
- Vesterberg, O., Svensson, H. Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins. Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).
- Righetti, P. G. . Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , 1 (1983).
- Vesterberg, O. Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes. Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).
- Bier, M. Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis. Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).
- Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation. Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).
- Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure. Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).
- Wagner, L., et al. Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization. Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).
- Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing. Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).
- Yu, J. J., et al. Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice. Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).
- Riyong, D., et al. Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).
- Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins. Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).
- Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d’Enfert, C. Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans. PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides. Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).
- Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre. Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).
- Craik, D. J. Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends. Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).
- Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif. Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).
- Stoecklin, W. Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).
- Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).
- Veerapandian, R., Vediyappan, G. Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms. Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).
- Chaffin, W. L. Candida albicans cell wall proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).
