הפרדת מולקולות ביו-אקטיביות קטנות, פפטידים ממקורות טבעיים וחלבונים מחיידקים על ידי שיטת התמקדות איזואלקטריים
Summary
המטרה היא לאנגיופלסטיקה ולבודד אקטיביים מולקולות קטנות, פפטידים מתוך תמצית צמח מורכב, חלבונים של חיידקים פתוגניים על ידי שימוש בשיטת מיקוד בשלב נוזלי (הארה ב) שיטה. יתרה מזאת, המולקולות המופרדות זוהו ופעילותם הביוביולוגית אושרה.
Abstract
מוצרים טבעיים הנגזרים מצמחים ומחיידקים הם מקור עשיר של מולקולות אקטיביים. לפני השימוש שלהם, המולקולות הפעילים מתמציות מורכבות חייבים להיות מטוהרים עבור יישומים במורד הזרם. יש שיטות כרומטוגרפיות שונות זמין למטרה זו עדיין לא כל המעבדות יכול להרשות לעצמם שיטות ביצועים גבוהים בידוד מדגימות ביולוגיות מורכבות יכול להיות קשה. כאן אנו מדגימים כי הסדר שלב נוזלי איזואלקטרי התמקדות (הפנים) יכול להפריד מולקולות, כולל מולקולות קטנות פפטידים מפני תמציות צמחים מורכבים, מבוסס על נקודות איזואלקטריים שלהם (pI). השתמשנו בשיטה לקבלת משבר ואפיון ביולוגיים מורכבים. כהוכחה של המושג, אנחנו מצאנו את הצמח מתחת לתמצית צמחים בבידוד, בידוד משפחה של טרפנאיד סאפונין מולקולות קטנות פפטיד. כמו כן הדגמנו הפרדת חלבון מחיידקים יעילים באמצעות פטרייה אלביקנס פטריה כמערכת מודל.
Introduction
טיהור הbiomolecules מדגימות ביולוגיות מורכבות הוא צעד חיוני וקשה לעתים קרובות בניסויים ביולוגיים1. איזואלקטריים התמקדות (הארה ב) הוא מתאים הפרדה ברזולוציה גבוהה של biomolecules מורכבים שבו המוביל ampholytes לנסוע לפי הטעינה שלהם ולהקים את הדרגתי pH בשדה חשמלי3. המוביל המסחרי הראשון של חברת הקולנוע הארצי פותח על ידי אושל וסטברג בשנת 1964 וכפטנט4,5. אמולוציטים המוביל הם אליפטיות oligo-אמינו oligo-carboxylic חומצה מולקולות באורך משתנה ומסעף6. לאחר מכן, בוסטברג ואחרים שיפרו את המוביל אמולוציטים לשימוש המורחב שלהם בהפרדת biomolecules6,7.
שיטות להפרדת הbiomolecules כוללות אגקם ו פוליאקרילמיד ג’ל אלקטרופורזה, אלקטרופורזה דו מימדית ג’ל (2-DE), איזואלקטריים התמקדות, אלקטרופורזה קפילר, isotaקוזוהורזיס וטכניקות כרומטוגרפיים אחרים (למשל, ועוד, FPLC, כרומטוגרפיה)2. במהלך האירוע הומצא הארגון הבינלאומי של מילאנו ביר8בכלי שנקרא “Rotofor”. הוא ייסד את הקונספט והעיצוב של המכשיר הזה ותרם רבות לתיאוריית ההגירה האלקטרופיניטית. הצוות שלו פיתח גם מודל מתמטי של תהליך הפרדה אלקטרופלסטי לסימולציות מחשב9.
המנגנון הנוזלי הינו מנגנון מסתובב אופקית המורכב מליבת ניילון מחולק ל -20 תאים נקבובי ומים מחזורי קירור המים מוט קרמיקה. התאים הנקבובי מאפשרים למולקולות להגר דרך השלב המים בין האלקטרודות וההיתר לאיסוף דגימות מטוהרים תחת ואקום בשברים. מערכת טיהור זו יכולה לספק עד 1000 לטיהור מתקפל של מולקולה מסוימת ב-< 4 שעות. תכונה רבת ערך של מכשיר זה היא שניתן להחילם כצעד ראשון לטיהור מתערובת מורכבת או כצעד אחרון להשגת הטוהר10. אם מולקולת העניין היא חלבון, יתרון נוסף הוא שהמערך הטבעי שלו יישמר במהלך ההפרדה.
השימוש בשלב הנוזלי הינו דיווח נרחב עבור חלבונים, אנזימים וטיהור נוגדנים6,10,11,12,13,14. כאן נתאר את השימוש בגישה זו להפרדת וטיהור מולקולות קטנות ופפטידים מצמח המרפא ג’ימנמה. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים להתרכז ולטהר מולקולות קטנות פעילות מתוך תמצית צמחים עבור יישומים במטה בעלות נמוכה. בנוסף, אנו גם להדגים כי העשרה של חלבונים מתמצית חלבון מורכב מפטרייה אלביקנס פטריה15 במערכת זו מבוססת-החוץ כדוגמה השנייה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מולקולות קטנות ממקורות המוצר הטבעי (למשל, צמחים) כוללים מטבוליטים מורכבים מאוד מגוונים מאוד במבנה כימי. הם מאמינים כי הם מעורבים במנגנוני ההגנה של הצמח. בנוסף, פוליפפטידים נמצאים גם ברקמות הצמח22. המוצר הטבעי הזה מולקולות קטנות הם מקורות עשירים של מולקולות בדיקה לגילוי סמים ופ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה על מקורות המימון של החטיבה לביולוגיה ומרכז ג’ונסון לחקר הסרטן עבור פרסים קצרים והרה, בהתאמה GV. אנו מודים גם לפרס הפוסט-דוקטורט של K-INBRE לקרוואן. עבודה זו נתמכת בחלקו של פרס הפיתוח המוסדי (הרעיון) מן המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת מספר P20 GM103418. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית או המוסדות הלאומיים לבריאות. אנו מודים לסוקרים האנונימיים על הערותיהם השימושיות.
Materials
| 0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubator | Lab companion | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
| pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |
References
- Jankowska, U., et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).
- Pergande, M. R., Cologna, S. M. Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins. Proteomes. 5 (1), (2017).
- Stoyanov, A. IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution. Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).
- Vesterberg, O. A. Y. . Method of Isoelectric Fractionation. , (1964).
- Vesterberg, O., Svensson, H. Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins. Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).
- Righetti, P. G. . Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , 1 (1983).
- Vesterberg, O. Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes. Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).
- Bier, M. Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis. Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).
- Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation. Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).
- Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure. Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).
- Wagner, L., et al. Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization. Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).
- Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing. Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).
- Yu, J. J., et al. Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice. Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).
- Riyong, D., et al. Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).
- Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins. Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).
- Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d’Enfert, C. Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans. PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides. Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).
- Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre. Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).
- Craik, D. J. Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends. Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).
- Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif. Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).
- Stoecklin, W. Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).
- Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).
- Veerapandian, R., Vediyappan, G. Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms. Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).
- Chaffin, W. L. Candida albicans cell wall proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).
