Summary
웜 정렬/Worm_CP Caenorhabditis elegans 샘플을 곧게 하고 정렬하고 사전 학습 단계 없이 전체 웜 이미지 기반 assays를 득점하는 데 사용할 수 있는 간단한 FIJI/CellProfiler 워크플로우입니다. 우리는 고정 된 샘플에서 살아있는 동물 이나 지질 물방울에서 열 충격 유도 발현의 정량화에 웜 정렬 /Worm_CP 적용했습니다.
Abstract
고정 또는 마취된 C. elegans에서 이미지 데이터를 수집할 때 종종 발생하는 문제는 웜이 이웃과 교차하고 클러스터된다는 것입니다. 이 문제는 벌레의 밀도가 증가함에 따라 악화되고 이미징 및 정량화에 대한 과제를 만듭니다. 우리는 피지 기반워크플로우인 웜정렬을 개발하여 C. elegans의 원시 이미지 데이터에서 사용자가 선택한, 곧게 펴고 정렬된 웜의 단일 채널 몽타주를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 웜 정렬은 사용자 또는 분석 알고리즘에 대한 사전 교육이 필요하지 않은 간단하고 사용자 친화적인 워크플로입니다. 웜 정렬로 생성된 몽타주들은 웜, 분류 및 표현의 육안 검사를 도울 수 있습니다. 또한, 웜 정렬의 출력은 피지 또는 다른 이미지 분석 소프트웨어 플랫폼에서 단일 웜에서 형광 강도의 후속 정량화에 사용될 수 있다. 웜 정렬 출력을 오픈 소스 CellProfiler 소프트웨어를 사용하는 파이프라인인 Worm_CP 가져옵니다. CellProfiler의 유연성은 고콘텐츠 스크리닝을 위한 추가 모듈을 통합할 수 있게 해줍니다. 실용적인 예로, 우리는 두 개의 데이터 세트에 파이프라인을 사용했습니다: 첫 번째 데이터 세트는 열 충격 유도 유전자 hsp-70의프로모터의 통제 하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 열 충격 기자 웜의 이미지이며, 두 번째 데이터 세트는 고정 된 벌레로부터 얻은 이미지이며, 형광 염색으로 지방 상점에 얼룩이 있는 이미지입니다.
Introduction
비교적 간단한 유기체인 선충 C. elegans는인간 질병을 연구하는 데 매우 유용한 모델 시스템입니다. C. elegans 게놈에 있는 유전자의 대략 38%는 인간1,2에있는 기능적인 대응이 있습니다. C. elegans의 독특한 특성 중 하나는 광학적으로 투명하여 조직 전반에 걸쳐 형광 기자의 세포 발현 (sub) 세포 발현에 관한 생체 내 정보에 쉽게 액세스 할 수 있다는 것입니다. 이로 인해 C. elegans는 이미지 기반 플랫폼3을사용하여 고콘텐츠 스크린의 주요 모델 유기체로 만듭니다. 그러나 이러한 연구를 복잡하게 만드는 한 가지 문제는 벌레의 조밀한 집단을 이미징할 때 교차하고 클러스터링하는 경향이 있어 개별 웜을 비교하고 다운스트림 이미지 분석 및 양을 흐리게 한다는 것입니다.
이 문제를 극복하는 기존 솔루션은 일반적으로 마이크로 유체 설정4의사용을 통해 와 같은 배양 및 이미징 프로토콜의 최적화에 의존하여 단일 웜을 별도의 이미지5,6으로캡처할 수 있도록 합니다. 다른 사람들은 집단이 뭉친 집단에서도 단일 웜을 인식할 수 있도록 기계 학습 알고리즘을 적용했습니다. 후자의 훌륭한 예는 오픈 소스 이미지 분석 플랫폼, CellProfiler7의모듈식 확장인 WormToolbox입니다. WormToolbox는 C. elegans분석을 위한 높은 처리량 및 고함량 솔루션을 제공하며, 추가 분석 모듈을 쉽게 포함할 수 있기 때문에 CellProfiler에 포함된 이점을 명확하게 제공합니다. WormToolbox는 미리 학습된 모델(DefaultWormModel.xml과 함께 제공되지만, 각 새 응용 프로그램에 대해 일반적으로 기계 학습 알고리즘의 재교육이 필요합니다. 이 작업을 수행하는 방법에 대한 온라인 자습서는 Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/)에서 사용할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 WormToolbox를 설치하고 사용하려면 초보자 사용자에게 상당한 시간 투자가 필요합니다.
여기서는 문화에 대한 간단하고 비용 효율적이고 시간 효율적인 프로토콜과 C. elegans의 이미지 모집단을 설명합니다. 획득한 이미지에서 개별 웜을 평가할 수 있도록 웜 정렬이라는 간단한 오픈 소스 FIJI 기반 워크플로우를 개발했습니다. 웜 정렬은 곧게 펴고 정렬된 웜의 단일 채널 또는 다중 채널 몽타주를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 첫째, 사용자는 머리에서 꼬리까지 선을 그려 분석을 위해 개별 웜을 수동으로 선택해야 합니다. 웜 정렬은 이 선택을 사용하여 개요 이미지에서 선택한 웜을 자르고 선택한 웜이 곧게 펴지고 정렬되어 시각적 비교 및 프레젠테이션을 용이하게 하는 몽타주를 생성합니다.
또한, 웜 정렬의 출력은 피지 또는 다른 이미지 분석 소프트웨어 플랫폼에서 단일 웜에서 형광 강도의 후속 정량화에 사용될 수 있다. 웜 정렬 출력을 오픈 소스 CellProfiler 소프트웨어를 사용하는 파이프라인인 Worm_CP 가져옵니다. CellProfiler의 유연성은 고콘텐츠 스크리닝을 위한 추가 모듈을 통합할 수 있게 해줍니다. 우리는 Worm_CP 파이프 라인을 사용하여 열 충격 반응을 정량화하고, 고온8과같은 스트레스로 인해 잘못 접힌 단백질을 재접는 잘 보존 된 보호 메커니즘입니다. 구체적으로, 우리는 열 충격 유도 유전자, hsp-70 (C12C8.1)의 발기인이 녹색 형광 단백질 (GFP)9를구동통합 다중 복사 트랜스진을 운반하는 웜에 파이프 라인을 적용했다. 우리는 또한 지질 물방울 (LDs), C. elegans10의주요 지방 저장 세포기관을 시각화하는 형광 염료로 표시 된 고정 동물에 Worm_CP 파이프 라인을 사용했다. 이 워크플로에는 WormToolBox에서 제공하는 처리량이 없지만 이미지 기반 C. elegans 실험의 시각적 프레젠테이션 및 분석을 위한 사용자 친화적이고 간단한 대안입니다.
Protocol
1. 지질 방울 (BODIPY)10에 대한 형광 염료를 사용하여 지방 함량 이미징을위한 웜의 고정
- 표준 절차2에따라 표백하여 C. 예레건의 동기화 된 인구를 준비하십시오. 조건당 9cm 선충 성장 미디어(NGM) 플레이트에 약 1,000L1단 웜을 플레이트.
참고: 처리 시 웜이 손실되어 실제로 정량화된 웜보다 더 많은 웜이 준비됩니다. - 젊은 성인 단계에서 동물을 이미지 (약 50 시간 포스트 L1 도금 20 °C), 원추형 튜브에 M9의 15 mL각 9cm 플레이트를 세척하고, 원심 분리기에서 252 x g에서 1 분 동안, 상퍼를 제거합니다.
- 세척을 반복하고 벌레의 펠릿 위에 M9의 1 mL을 둡니다.
- 낮은 보존 팁을 사용하여 2mL 저단백질 결합 마이크로센심분리기 튜브에 웜을 함유하는 M9의 1mL를 전달한다.
- 마이크로 센트심분리기에서 252 x g로 1분 간 회전하고 상체를 제거하여 튜브 바닥의 웜 펠릿을 만지지 않도록 주의하십시오.
- 4,4-디플루오로-1,3,5,7-펜타메틸-4-보라-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) 염색을 사용하여 지방 함량을 모니터링하기 위해10 (재료의 표),웜 펠릿에 60% 이소프로판올의 0.5mL를 3분11에첨가하거나, 10분 동안 2mL의 얼음차가운 메탄올을 첨가하여 벌레를 수정한다. 두 절차 모두 30s마다 튜브를 반전시면 됩니다.
주의: 메탄올이 선택한 고정 시약인 경우 독성으로 인해 연기 후드에서 이 단계를 수행해야 합니다. - 웜 펠릿을 건드리지 않고 가능한 한 많은 고정을 제거하고 M9의 1 mL을 추가하십시오. 벌레가 3-5 분 동안 튜브의 바닥에 정착하자.
- M9 의 1 mL로 다시 세척, 벌레가 정착하고 관에 약 50 μL을 떠나, 슈퍼 나탄을 제거하자. 클램프를 사용하여 튜브를 고정합니다.
- 액체 질소에서 단단히 닫힌 튜브를 급락한 다음 ~ 40 °C의 따뜻한 수조로 떨어뜨려 벌레를 동결하십시오.
- 1.9 단계를 한 번 더 반복합니다.
- M9에서 희석된 BODIPY0.5mL을 1 μg/μL의 최종 농도로 추가하고 실온에서 1시간 동안 회전에 놓습니다.
- 1 시간 후, 벌레가 3-5 분 동안 튜브의 바닥에 정착하자.
- 상체를 제거하고 M9의 1mL을 추가합니다.
- 웜이 바닥에 정착하여 상복부을 제거합니다.
참고 : 또는, 이 형태에 영향을주지 않는 것처럼, 1 분 동안 252 x g에서 아래로 회전 할 수 있습니다. - M9의 0.5mL를 추가합니다.
참고: 고정제가 60% 이소프로판올인 경우 웜은 48시간 이내에만 사용할 수 있습니다. 고정이 메탄올인 경우 웜은 24시간 이내에 활용되어야 합니다.
2. 벌레를 장착하기 위해 아가로즈 패드를 준비
참고 : 아가로즈 패드를 준비하는 동안 중요한 단계는 일반 두께의 패드를 얻는 것입니다. 그렇지 않으면 패드를 가로 지르는 웜이 다른 초점 평면에 있어 더 넓은 시야의 집중 된 이미지를 얻는 것이 까다롭습니다.
- 비커 또는 원추형 플라스크에 멸균 된 H2O의 10 mL에 아가로즈 0.2 g을 추가하여 2 % 아가로즈 패드를 준비하십시오. 아가로즈가 끓기 시작할 때까지 전자 레인지에서 30 s를 가열합니다.
참고: 거품이 나타나자마자 과열되고 멈추지 마십시오. 그렇지 않으면 아가로즈의 점도를 증가시켜 원하는 패드 두께를 달성하기가 더 어려워집니다. - 아가로즈가 녹으면 1000 μL 파이펫 팁을 사용하여 현미경 유리 슬라이드의 중앙에 녹인 아가로즈 한 방울을 분배합니다. 즉시, 그러나 섬세하게, 아가로즈 드롭에 매우 가까운 다른 유리 슬라이드를 잡고 최고의 현미경 결과를 위해 일반 두께의 패드를 형성하기 위해 아가로즈에 놓습니다.
참고: 높이에서 상단 슬라이드를 해제하면 거품이 형성될 뿐만 아니라 고르지 않은 패드가 생성됩니다. 또는 패드와 함께 슬라이드를 측면에 있는 두 개의 유리 슬라이드를 사용할 수도 있으며 각 슬라이드에 얇은 테이프 레이어가 있습니다. - 최소 2-3 분 후, 부드럽게 상단 슬라이드를 제거합니다. 상단 슬라이드의 측면을 사용하여 패드를 다듬어 사각형 모양으로 만듭니다. 사용 전에 패드가 건조되지 않도록 5 분 이내에 벌레를 장착하십시오.
3. 이미징을 위한 고정 웜 장착
- 분젠 버너의 불꽃에 얇은 유리 모세관을 연장하여 입 마이크로피펫을만듭니다(도 1A). 화염에 연장 후, 두 조각으로 모세관을 깰(도 1B). 가장 적절 한 선택, 일반적으로 가장 긴, 그리고 모세관의 끝이 물을 흡인 하려고 하 여 열려 있는지 여부를 테스트.
참고: 액체가 모세관에 들어오지 않으면 너무 얇거나 막혔습니다. 구멍이 너무 커지면 벌레가 흡인될 만큼 절단을 피하면서 모세관의 끝을 가위로 부드럽게 자릅니다. - 유리 모세관을 3.1단계에서 모세관 어댑터(도1C)로연결하고 6mm 실리콘 튜브의 다른 쪽 끝을 0.2 μm 필터로 연결하여 다른 쪽 끝에 3mm 실리콘 튜브에 부착한다(도1C). 1mL 필터팁(도 1C)을3mm 실리콘 튜브의 자유 끝에 연결하여 액체를 흡인시합니다.
참고: 0.2 μm 필터는 실험자의 입과 모세관 사이에 첨가되어 실험자의 최대 안전성을 보장합니다. 마우스배아(12)를처리하는 데 사용되는 구강 마이크로피펫에도 유사한 용액이 사용된다. 입 마이크로 파이프가 더 이상 액체를 심는 하지 않는 경우 필터 (일반적으로 몇 개월마다)를 변경합니다. - 해부 현미경의 밑에 입 마이크로피펫을 사용하여, 고정된 벌레의 벌레 펠릿 의 주위에 가능한 한 많은 액체를 제거합니다(그림 2).
참고: 수동 마이크로파이프를 사용하여 피펫팅 상체를 피펫하는 것은 가능한 한 많은 초중화를 제거하기 위해 3.1~ 3.3 단계의 입 파이펫에 대한 대안으로 사용될 수 있습니다. 장착 매체의 6 μL을 추가합니다. 그러나 패드의 과도한 액체가 희소한 웜 밀도를 생성하기 때문에 이 방법이 효율적으로 작동하지 않아 이미징이 시간이 많이 소요됩니다. 3.6 단계를 다시 시작합니다. 튜브 의 바닥을보고 파이펫이 웜을 흡인하지 않는지 확인합니다. - 튜브 바닥에 10 μL의 마운팅매체(재료 표)를빠르게 추가합니다.
- 플라스틱 파이펫 팁의 측면에 웜이 달라붙지 않도록 세제(0.01% 트리톤)의 흔적이 있는 PBS에서 10μL 팁을 헹구습니다. 팁의 맨 끝을 가위로 잘라냅니다.
- 2.3단계에서 제조된 아가로즈 패드에 벌레를 함유한 장착 매체의 8μL을 전달한다. 현미경의 밑에, 부드럽게 벌레의 겹치지 않기 위하여 슬라이드를 흔들어.
- 아가로즈 패드에 18mm x 18mm 커버슬립(그림3)으로장착 매체의 드롭을 덮습니다.
참고: 작은 커버립은 웜에 적은 압력을 가하기 때문에 선호됩니다. 핀셋으로 커버슬립을 잡고 커버슬립의 한쪽 가장자리를 아가로즈 패드에 바르고 핀셋으로 커버슬립을 부드럽게 증착합니다.
4. 이미징을 위한 살아있는 웜 장착
참고: 라이브 웜을 이미지하려면 패드에 고정해야 합니다. 이를 달성하는 한 가지 방법은 니코틴 수용체 작용제인 레바미솔(재료표)으로 마비시키는것입니다.
- 3mM 레바미솔의 파이펫 3-4 μL은 M9에 용해되어 2.3단계에서 생성된 아가로즈 패드에 용해됩니다.
참고: 웜이 서로 위에 있지 않지만 웜이 패드에 너무 희박하지 않은 액체가 너무 많지 않은 충분한 액체 부피가 있어야 합니다. 숙련된 웜 피커는 레바미솔 3μL을 사용할 수 있습니다. 경험이 적은 피커레아미솔이 완전히 증발하지 않도록 더 많은 양의 레바미솔을 추가해야 할 수도 있습니다. - 레바미솔을 떨어뜨리기 위해 조건당 30-50개의 웜을 선택합니다.
- 아가로즈 패드에 레바미솔 한 방울을 18mm x 18mm 커버슬립으로 덮습니다. 마비 에이전트가 결국 벌레의 죽음으로 이어질 것이기 때문에 1 시간 이내에 이미지 웜.
5. 성형광 현미경으로 이미징 슬라이드
- 균일 한 두께의 아가로즈 패드로, 형광 현미경의 20 x 목표와 예를 들어 6 x 6 또는 7 x 7 큰 이미지를 사용하여 한 번에 슬라이드의 모든 웜을 이미지. 패드의 두께가 균일하지 않은 경우 동일한 슬라이드의 작은 3 x 3 또는 4 x 4 이미지를 여러 개 획득하십시오.
- 모든 조건에 대해 형광 강도 및 노출 시간에 동일한 설정을 사용합니다. 각 설정을 조정하여 가장 밝은 강도를 가지는 슬라이드에 맞게 조정하여 픽셀 채도가 없도록 합니다. 이미지 수집에 대한 구체적인 지침은 현미경 제조업체의 지침을 따르십시오.
6. 웜 정렬 피지 파이프 라인을 사용하여 정렬 된 단일 웜의 몽타주 이미지 만들기
- https://imagej.net/Fiji 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어 패키지 피지13/ImageJ14를 설치합니다. FIJI의 사전 설치를 사용할 수 있는 경우 매크로에 사용되는 일부 함수(예: 테이블 함수)에 사용되는 일부 함수가 이를 필요로 하므로 버전 1.52a 이상으로 업데이트되었는지 확인합니다. Github에서 웜 정렬 매크로를 다운로드합니다: https://github.com/hannekeo/Worm-align.
- 피지를 열고 웜 정렬 매크로를 실행합니다. 플러그인 | 클릭하여 웜 정렬 실행 매크로 | 피지 메인 메뉴 바(그림 S1)에서 실행합니다. 이제 컴퓨터에서 Worm-align.ijm 스크립트를 찾습니다.
- 매크로는 이미지의 위치를 요청하여 초기화됩니다. 파이프라인은 단일 채널 및 다중 채널 형광이미지(그림 S2)에서모두 작동합니다. 입력 폴더를 선택하면 매크로가 자동으로 모든 결과가 저장되는 출력 폴더를 생성합니다(그림S3).
참고: 선택한 폴더에는 다른 파일 형식이 있으면 매크로가 충돌할 수 있으므로 이미지 파일만 포함되어 있는 것이 중요합니다. 이상적으로는 동일한 현미경 설정으로 캡처된 이미지만 그룹화하는 것이 좋습니다. 웜 정렬은 nd2, czi, tif, rgb, jpg 및 png를 포함한 다양한 파일 형식을 허용합니다. 출력 폴더의 이름은 입력 폴더와 동일하며, '_output'가 postfix로 추가됩니다(예: 입력 폴더가 '이미지'인 경우)는 출력이 'images_output'에서 발견됩니다. 출력 폴더에는 데이터가 저장되는 4개의 하위 폴더가 포함됩니다. - 매크로가 입력 폴더에서 첫 번째 이미지를 열고 대표 이미지로 사용하여 몽타주를 생성하는 설정을 추출하도록 허용합니다.
참고: 웜 정렬은 입력 폴더의 첫 번째 이미지를 자동으로 선택하여 폴더의 다른 모든 이미지에 적용되는 설정을 생성합니다. 다른 이미지가 데이터 집합을 더 대표하는 것으로 간주되는 경우 입력 폴더에 이미지 복사본을 저장하여 이 이미지를 선택하여 이제 목록 상단에 나열되도록 이름을 변경합니다(예: '0_RepresentativeImage'). - 직선 드로잉 도구를 사용하면 웜(그림S4)의너비에 선을 그리고 이 선의 길이를 사용하여 단일 웜에 대한 자른 영역의 높이를 결정합니다. 각 채널에 대해 이름, 조회 테이블(LUT), 강도 설정(B&C) 및 몽타주에 포함해야 하는지 여부를 지정합니다(그림S4).
참고: 이러한 매개 변수는 출력 폴더의 CellProfiler 하위 폴더에 있는 설정 파일인 설정.csv에기록되고 저장됩니다. - 모든 설정이 캡처되면 사용자는 적용된설정(그림 S5)을적용한 후 이미지가 어떻게 보이는지 보여집니다. 설정이 충분하면 상단 상자를 선택합니다. 몽타주 생성 옵션 선택(필요한 경우 진드기 제거): 1. 각 단일 이미지에 대해 선택한 웜의 몽타주를 생성하거나 2. 입력 폴더의 모든 이미지에 선택한 모든 웜이 하나의 몽타주에 결합되는 결합된 몽타주를 생성합니다. 확인을 클릭하여 매크로의 나머지 부분을 실행합니다.
참고: 'OK'를 클릭하기 전에 상단 상자를 체크하지 않으면 매크로가 설정을 다시 실행하므로 이미지 설정을 최적화할 수 있습니다. - 웜 정렬 파이프라인이 입력 폴더의 모든 이미지를 엽니다. 각 이미지에 대해 , 몽타주에 포함되는 모든 웜의 세로축에 선을 그리거나 정량화(그림4 및 도S6)를사용하여 '분할된 선' 도구(FIJI 메인 메뉴 바)를 사용합니다. 웜의 적절한 정렬을 보장하기 위해 머리에서 테일 엔드(또는 그 반대의 경우도 마찬가지)와 웜의 전체 길이를 따라 일관되게 선을 그립니다(그림 4B에서"좋음" 및 "불량" 선 그리기의 예 참조).
- Ctrl+T. 웜 정렬을 클릭하여 ROI 관리자에추가된 라인을 웜 너비 매개변수(단계 6.4로 설정)와 함께 사용하여 선택한 단일 웜의 자른 이미지를 생성합니다. 라인 ROI의 컬렉션은 '데이터' 하위 폴더에 저장됩니다. 이 폴더에는 선을 보여주는 원본 이미지의 복사본과 웜 수도 포함되어 있습니다. 선은 Glasbey_on_dark 조회 테이블로 색상으로 구분됩니다. 바로진 웜의 이미지는 출력 폴더의 single_worms 하위 폴더에 저장됩니다. 또한 이 프로토콜의 6.6 단계에서 선택하면 웜 정렬은 개요 이미지 및/또는 입력 폴더의 모든 개요 이미지에 대해 선택한 모든 웜의 몽타주를 생성합니다(그림 4C 및 그림 S7참조). 이러한 몽타주 출력 폴더의 '정렬된' 하위 폴더에서 찾을 수 있습니다.
7. 자동화된 CellProfiler 파이프라인에서 웜 정렬의 출력을 사용하여 단일 웜 형광 강도 분석
- 웜 정렬 출력의 다운스트림 데이터 처리 및 분석을 위해 https://cellprofiler.org/ 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어 패키지 'CellProfiler15,16'을 다운로드하고 설치합니다. GitHub에서 Worm_CP.cpproj 파이프라인 다운로드: https://github.com/hannekeo/Worm-align
참고: 여기에 설명된 예제 파이프라인은 CellProfiler2.2.0을 사용하여 구성되었으며 이후 버전의 CellProfiler에서 실행되지 않을 수 있습니다. - Worms_CP.cpproj 파이프라인을 시작하기 전에 모든 예상 출력 이미지가 웜 정렬 출력 폴더의 CellProfiler 하위 폴더에 있는지 확인합니다: 원본 이미지의 처리된 복사본(이름: Original_), 웜 모집단의 바이너리 이미지 마스크(이름: Mask_), 선택한 웜에 그려진 선의 선 마스크(이름: Lines_) 및 원본 이미지에 있는 각 채널을 나타내는 하나의 이미지(명명된 채널).
- 단일 웜에서 형광 강도를 정량화하려면 이미지 입력 모듈을 클릭하고 여기에서 파일 및 폴더를 삭제라고 하는 창으로 CellProfiler 출력 폴더를 드래그합니다. 이전 분석에서 이미지 목록이 있는 경우 먼저 창을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 파일 목록 지우기로 제거합니다. 이미지 목록에서 '설정.csv' 파일을 제외하려면 필터설정(그림 S8)에대해 '확장은 tif, tiff, ome.tif 또는 'ome.tiff'로 '이미지 전용' 또는 '사용자 지정'을 선택합니다.
- 메타데이터 입력 모듈을 클릭합니다. 두 번째 추출 방법에서는 노란색 폴더를 클릭하고 WormAlign 출력폴더(그림 S9)에서 CellProfiler 하위 폴더를 찾습니다. 설정.csv 파일을 선택하고 CSV 파일의 메타데이터를 이미지(채널 메타데이터)와 일치시켜 파일의 설정을 CellProfiler 출력에 연결합니다.
- NameAndType 입력 모듈을 클릭하고 정량화할 원본 이미지의 각 채널에 대한 새 이미지를 삽입합니다.
참고: 이미 예제 파이프라인에 있는 웜 마스크, 두 개의 컬러 이미지, 선 마스크 및 원본 이미지, 세 개의 회색 스케일 이미지(녹색 및 빨간색 채널)가 있습니다. 원본 이미지가 예제 이미지보다 채널이 많거나 적으면 이 모듈의 목록을 조정해야 합니다. - 모든 열 레이블/마스크/웜의 이미지 이름이 올바른지 확인합니다.
참고: 한 줄의 이미지 이름은 모두 분석할 동일한 초기 이미지와 일치해야 합니다. 이미지 분석 과정에서 실수가 발생하면 일부 출력 이미지가 누락되고 세 열 레이블/마스크/웜 아래에 있는 이름은 각 줄에 대해 더 이상 동일한 초기 이미지와 일치하지 않습니다. 이 경우 실수가 있는 위치를 찾습니다. - 셀프로파일러에서 출력을 저장하는 폴더를 선택하려면 출력 보기 설정을 누릅니다.
- 테스트 모드 시작을 클릭합니다. 테스트 모드에서 한 번은 데이터 집합의 첫 번째 이미지에 적용하여 파이프라인의 설정을 다시 확인하거나 실행(파이프라인의 모든 활성 모듈을 통해 실행됨) 또는 단계(파이프라인의 한 모듈을 한 번에 하나씩 실행)를 클릭합니다.
참고: 테스트 모드에서추출된 측정값은 파이프라인에 ExportToSpreadsheet 모듈이 있는 경우에도 내보내지 않습니다. - 파이프라인이 수행해야 하는 방식으로 수행되면 테스트 종료 모드를 클릭한 다음 이미지 분석을 누릅니다. 현재 구성된 바와 같이, Worms_CP (1)은 Mask_ 영상을 사용하여 거친 웜 마스크와 Lines_ 이미지(도S10A)를분류하여 선택한 웜을 골충하고 단일 웜 마스크(도S10C)를생성하며, (2) 식별및 마스크된 웜의 입력 이미지에 존재하는 모든 채널의 형광 강도를 측정한다. 파이프라인은 또한 배경강도(도 S10B)를측정하고 모든 이미지를 그에 따라 수정할 수 있습니다(예를 들어 측정된 매개변수의 이름으로 단어 임계값으로 표시됨 Intensity_MeanIntensity_green_threshold), (3) 선택한 웜의 크기를 측정하고( 4) 모든 측정된 매개변수(도S10D)를내보낼 수 있다.
- 선택한 출력 폴더에 저장된 두 개의 csv 파일, 웜.csv 및 선.csv로 구성된 Worm_CP 출력을 엽니다(그림 S11참조). 이러한 파일은 사후 처리 및 보고를 위해 Excel 또는 R(Studio)에서 열 수 있습니다. 이미지 데이터당 추가 출력이 필요한 경우 파이프라인의 ExportToSpreadsheet 모듈에서 이 것을 선택할 수 있습니다.
Representative Results
이 프로토콜에 설명된 방법에 따라 C. elegans를 배양하고 이미징하면 웜 개체수의 큰 개요 이미지가 생성됩니다. 이러한 이미지에서 웜의 육안 검사 및 분류를 용이하게 하기 위해 웜 정렬을 개발했습니다. 웜 정렬은 간단하고 사용자 친화적인 FIJI 스크립트로 곧게 펴고 정렬된 웜의 몽타주를 만드는 데 사용할 수 있습니다. 웜은 웜의 세로 축을 따라 선을 그려 개요 이미지에서 선택됩니다. 선택한 각 웜에는 숫자가 할당되고, 자르고 곧게 펴고, 몽타주에 추가됩니다. 몽타주 이미지 당 생성하거나 원래 입력 폴더의 모든 이미지를 결합할 수 있습니다.
예상대로 파이프라인의 출력은 주로 이미지 위에 그려진 선의 품질에 따라 달라집니다. 이 점을 설명하기 위해 그림 4에서는 여러 줄 예제와 웜 정렬의 출력이 표시됩니다. 머리에서 꼬리 끝까지 전체 선이 제대로 정렬된 웜("양호"이라고 표시)을 생성합니다. 도 4는 웜 정렬을 실행하는 동안 부정확성을 추적하는 것이 정렬의 출력에 미치는 영향을 보여줍니다. 그림 4C에포함 된 점타 4C에 포함 된 점타에서, 그들은 웜의 적절한 정렬을 방해로, 다음과 같은 오류를 피하기 위해주의를 기울여야한다 :
- 머리에서 꼬리까지 벌레의 일관성없는 추적 ("꼬리에서 머리까지"라고 표시). 이렇게 하면 웜이 정렬에서 서로 다른 방향(즉, 꼬리대머리 대 머리-투-테일)으로 방향을 지정합니다.
- 불완전한 추적("불완전"이라고 표시). 이것은 몽타주에 대해 잘라낸 것으로 추적된 웜의 일부만 발생합니다.
- 단일 추적에 여러 웜을 포함합니다("두 개의 머리가 있는 웜"이라고 표시). 이로 인해 이웃이 몽타주 패널에 삽입됩니다.
- 이미지에 임의의 선을 추가합니다("임의"라고 표시). 이것은 몽타주에 임의의 패널의 삽입귀착됩니다.
몽타주를 만들기 위해 두 개의 개별 선이 교차하거나("교차"라고 표시됨) 또는 각 선이 개별 웜의 전체 길이를 추적하는 한 웜의 양쪽 끝에 결합되는 경우 문제가 되지 않습니다. 그러나 교차하는 웜의 경우, 전체 길이의 직선 웜이 몽타주에서 웜 "교차1"과 웜 "교차2"에 나타나지만(그림 5A-B참조), 이러한 웜이 원래 개요 이미지에서 서로 교차하는 것이 눈에 띈다. 따라서, 교차선의 시각적 식별은 몽타주(도5B)에서개별 웜의 패널뿐만 아니라 '데이터' 서브폴더(도5A)에서발견되는 오버레이 이미지로부터 가능하다는 결론을 내릴 수 있다. 또한 웜/라인의 중복은 웜 정렬에 의해 처리된 각 이미지에 대해 생성된 품질 관리(QC) 테이블에서 식별하고 데이터 하위 폴더에 저장할 수 있습니다. 이 표는 이미지에 그려진 각 라인 ROI에 대해 세 가지 매개 변수를 기록합니다(그림 5C참조): 이 중 길이는 웜 크기의 좋은 지표인 라인 ROI의 길이를 나타냅니다. 웜 번호는 개요 이미지에 선이 그려진 순서를 나타냅니다. 마지막으로 마지막 열은 문제의 웜/선과 이미지에서 선택한 다른 웜/선 사이에 겹치는지 여부를 나타냅니다. 겹치는 경우 이 열의 숫자는 웜 번호 열에 나열된 번호열과 다릅니다. 오버레이 이미지와 함께, QC 테이블은 웜이 몽타주 및 / 또는 정량화에서 제외되어야하는 학습 된 결정을 내릴 연구원을 지원해야합니다.
웜 정렬의 출력은 단일 웜에서 형광 강도의 후속 정량화에 사용될 수 있다. FIJI에서 라인 ROI는 원래 이미지 데이터에서 형광 강도를 측정하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어 Github의 웜 정렬 리포지토리에서 찾을 수 있는 간단한 FIJI 스크립트 '웜-퀀트.ijm'을 실행하여 볼 수 있다. 또는 웜 정렬 출력을 타사 이미지 분석 소프트웨어로 가져올 수 있습니다. 셀프로파일러에서 생성된 파이프라인인 두 데이터 집합의 웜 정렬 출력을 Worm_CP 가져옵니다. Worm_CP 웜 정렬 출력 폴더의 'CellProfiler' 하위 폴더에 있는 파일을 사용하여 웜 정렬 매크로를 실행하는 동안 선택한 개별 웜의 세분화 마스크를 미세 조정합니다. 특히, 라인 마스크(이름: Lines_)를 사용하여 이진 마스크에서 볼 수 있는 웜 모집단으로부터 선택된 웜을 격리합니다(이름: Mask_). 몽타주 생성에 문제가 되지는 않지만 개요이미지(그림 5A)에교차하는 선은 Worm_CP 파이프라인에 문제가 있다는 점에 유의해야 합니다. 이 경우, 도 5 D-E에설명되어 있습니다. Worm_CP 개별 웜의 식별을 돕기 위해 개별 ROI가 아닌 라인마스크(도 5D)를사용합니다. 웜 정렬을 실행하는 동안 두 번째로 그려진 교차선은 첫 번째 줄에 겹쳐지므로 이 선을 따라 강도는 1호선과 2선이 겹치는 비트를 포함하여 ROI2의 강도입니다. 따라서 CellProfiler는 line2를 하나의 개체로 분할하지만 line1은 line2와 교차하는 두 개체로 구분됩니다. 이는 CellProfiler가 웜 '교차1'(그림 5E)에 대해 두 개의 웜 마스크를 생성한다는 것을의미합니다. 최종 분석에서 이러한 이벤트를 제외하는 가장 쉬운 방법은 QC 테이블(데이터 하위 폴더)에서 교차하는 웜 수를 식별하고 CellProfiler 출력 파일에서 이러한 웜에 대한 측정값을 제거하는 것입니다. 웜은 반드시 피지와 CellProfiler에서 동일한 번호를 할당되지 않습니다 : CellProfiler 출력에서 피지 웜 번호를 식별하려면 '라인.csv 출력 파일의 Intensity_Max_Intensity 값을 볼 수 있습니다. 이미지당 '선.csv 테이블에 나타나는 Intensity_Max_Intensity 값은 해당 라인 ROI의 표시로 인해 웜 마스크가 골절됩니다.
개별 웜 마스크가 분할되면 Worm_CP 기록된 모든 채널에 대해 선택한 웜의 형광 강도를 측정할 수 있습니다. 모든 측정은 원래(원시) 이미지 데이터에서 가져온 것이지만 CellProfiler는 자동으로 0-1의 배율로 픽셀 강도를 재조정한다는 점에 유의해야 합니다. 이는 원시 픽셀 강도 값을 이미지에 대해 가능한 최대 픽셀 강도로 나누어 얻을 수 있습니다. 8비트 이미지의 경우 이 값은 255이며 16비트 이미지의 경우 65535입니다. 따라서 CellProfiler 강도 값은 원시 이미지 데이터와 동일한 값을 회복하기 위해 가능한 최대 강도 값을 곱해야 합니다. Worm_CP 출력은 선택한 출력 폴더에 저장된 두 개의 csv 파일인 '웜.csv'과 '라인.csv(lines.csv)으로 구성됩니다. 이러한 파일을 검사하는 동안 CellProfiler는 형광 강도와 관련된 많은 수의 매개 변수를 기록합니다. 이들 중, Intensity_IntegratedIntensity 웜당 총 형광(즉, 개별 웜의 마스크를 해석하는 모든 픽셀 내의 형광 강도의 합)에 해당한다. 매개 변수 Intensity_MeanIntensity 개별 웜 내의 평균 형광 강도를 지칭한다(즉, 개별 웜 내에 포함된 모든 픽셀에 대한 픽셀당 평균 형광 강도). 웜 마스크를 분할하는 동안 (작은) 오류가 발생하기 때문에 두 조건 사이의 개별 웜의 형광 측정을 비교할 때 MeanIntensity 측정을 사용하는 것이 좋습니다. 정량화된 측정에서 배경 형광을 빼고 싶다면 MeanIntensity_Threshold 명명 된 측정을 사용합니다.
우리는 지질 물방울 (LDs)에 통합형염료로 표시 된 고정 동물에서 형광 강도를 정량화하기 위해 Worm_CP 파이프 라인을 사용했다(도 6). 웜 정렬/Worm_CP 파이프라인으로부터 형광 정량화를 검증하기 위해, 우리는 WORM-align/Worm_CP 파이프라인 또는 FIJI/ImageJ의 수동 정량화에 의해 BODIPY 데이터 집합에서 동일한 웜 세트에서 형광 강도를 정량화했습니다. 수동 정량화는 모든 이미지의 어두운 배경 영역뿐만 아니라 각 웜을 순환하여 FIJI / ImageJ에서 수행되었다. 형광 강도는 ROI 관리자에서 측정되었고 이미지 배경에 대해 측정된 값은 설명된17과같이 각 웜의 웜 형광 측정에서 빼되었다. 우리는 야생 유형 (WT) N2 웜을 dbl-1 (nk3) 돌연변이체에 비교하여 지질 방울함량이 감소했습니다(18). 예상대로, 녹색 형광 강도는 두 가지방법(그림 6A, B)을가진 WT와 dbl-1(nk3) 웜 사이에 현저히 감소된다. 정렬된 웜의 예는 도 6C,D에서관찰될 수 있다. 지질 방울 함량은 수동 정량화를 사용하여 WT와 dbl-1(nk3) 사이에 17%(p-value&0.0001, 페어링되지 않은 t-test)를, 그리고 Worm_CP 파이프라인을 사용하여 14%(p-값=0.0051 미페어링 t-test)로 감소합니다. 두 정량화 방법을 모두 가진 dbl-1(nk3)에서 여기에서 관찰되는 지질 액적 함량의 감소는문헌(18)에따른다. 이는 Worm_CP CellProfiler 파이프라인을 사용하여 획득한 형광 이미지의 정량화가 수동 정량화와 유사하다는 것을 보여줍니다.
우리는 또한 열 충격 유도 유전자 hsp-70 (C12C8.1)9의통제하에 GFP를 표현하는 살아있는 벌레에서 열 충격 반응을 정량화하기 위하여 Worm_CP 이용했습니다. 그림 7은 열 반응형 hsp-70(C12C8.1)p::GFP 리포터를 운반하는 라이브 C. 엘레건의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 열 응력의 부재시, 벌레는 GFP 발현(도7A,B)을유도하지 않는다. 그러나, 벌레가 34°C에서 30분의 짧은 열 충격에 노출되면 GFP 발현(도7C,D)을유도한다. 열충격의 유무에 관계없이 GFP 발현 수준은 도 7E에서정량화된다.
그것은 스탠드로, Worm_CP 매우 기본적인 파이프 라인입니다. 그러나, 이 접근은 개별 웜 마스크의 보다 정확한 세분화를 가능하게 합니다, 이는 이미지에서 선택된 그 벌레에 있는 형광 강도의 보다 정확한 정량화를 가능하게 합니다. 이러한 이유로, 우리는 단지 라인 마스크를 사용하여, 피지에서 거친 정량화보다이 방법을 선호합니다. 또한 CellProfiler는 추가 분석 모듈을 파이프라인에 쉽게 포함할 수 있다는 이점을 제공합니다. 예를 들어 지질 방울 함량을 보는 데이터 집합의 경우 Worm_CP 파이프라인에 추가 모듈을 삽입하면 개요 이미지에서 선택한 웜에서 개별 물방울의 지질 방울 수와 형광 강도를 조사할 수 있습니다.
그림 1: 입 마이크로파이프 생성. 유리 모세관은 번젠버너(A)의불꽃에서 연장되어 얇은 길쭉한 사지(B)를 제공합니다. 확장 된 유리 모세관은 입 마이크로 피펫의 어댑터 조각에 연결됩니다. (C)입 마이크로파이프의 회로도. 입 마이크로피펫은 어댑터에 연결된 유리 모세관으로 조립되었습니다. 6mm 실리콘 튜브는 어댑터를 안전에 사용되는 0.2 μm 주사기 필터에 연결합니다. 필터의 다른 쪽 끝은 1mL 필터 팁으로 끝나는 3mm 실리콘 튜브에 부착됩니다. 실험자는 필터 팁을 통해 흡인할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 입 마이크로피펫을 사용하여 벌레 펠릿을 둘러싼 액체의 포부. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 아가로즈 패드에 누워 있는 벌레에 커버슬립을 추가하려면 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
도 4: 전사 기자 지방-7p를운반하는 살아있는 동물로부터 획득한 형광 이미지에 웜-정렬을 이용한 웜 스트레이트의 예: :장내 GFP 및 인두(myo-2p:tdtomato)의 적합한 공동 주입 마커.. (A)성인 3일째에 살아있는 벌레의 형광 현미경에 획득한 합성 영상의 스크린샷. 이미지는 Worm_align 열었으며 웜 정렬을 사용하여 웜의 세로 축을 따라 선이 그려졌습니다. (B)웜 정렬을 사용하여 웜의 축을 따라 선의 좋은 및 나쁜 드로잉을 주석으로 한 예와 함께(A)와같은 이미지의 스크린 샷. (C)잘못 정렬된 웜으로 상승할 수 있는 웜 위에 그려진 선의 예입니다. B. 이미지에서 선택된 웜의 웜 정렬 출력은 녹색 형광 강도=1, 노출=60 ms 및 적색 형광 강도 = 8, 노출=60 ms. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하여 반전된 광야 현미경(재료 표 참조)에 대한 20배 의 목표로 촬영하였다.
그림 5: 교차하는 웜에 웜 정렬을 사용하여 곧게 펴는 웜의 예입니다. (A)전사 기자 지방-7p를들고 있는 성인이 된 동물의 3일째에 살아있는 벌레의 형광 현미경으로 획득한 합성 영상의 스크린샷: :GFP 내장및 인두에 적색 공동 주입마커(myo-2p:tdtomato). 교차하는 웜은 "교차1" 및 "교차"라고 표시되며 겹치지 않는 웜은 "good3" 및 "good4"로 표시됩니다. (B)선택된 바로간 웜을 나타내는 웜 정렬에 의해 생성된 몽타주(A). 몽타주에서 는 벌레 1과 2가 원본 이미지에 교차하고 있었다는 것이 눈에 띈다(웜은 "교차1"과 "교차2"로 표시). (C)웜 정렬에서 QC 테이블의 스크린샷이 웜이 교차하는 경우를 발견할 수 있습니다. 길이: ROI 라인의 길이; 웜 번호: 선이 그려진 순서; 마지막 열은 관심 있는 웜/줄과 다른 웜 사이에 겹치는지 여부를 나타냅니다. 이 예에서 첫 번째 원시(웜 넘버1)의 웜은 마지막 열의 숫자 "2"로 표시된 웜 번호 2와 겹칩니다. (D)A.(E) A에서 선택된 4개의 웜에웜-정렬으로 그려진 선의 스크린샷은 A에서 선택된 4개의 웜에 웜 정렬에 의해 생성된 마스크의 스크린샷으로, 교차하는 두 웜에 대한 마스크가 어떻게 렌더링되는지를 보여준다. 이 경우, 하나 대신 두 개의 마스크는 이제 웜 "교차1"에 대응한다. 이미지는 녹색 형광 강도 =1, 노출 = 60ms 및 적색 형광 강도 = 8, 노출 = 60 ms. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하여 반전 된 광장 현미경 (재료 표 참조)에 20 배 의 목표로 촬영했습니다.
그림 6: Worm_CP 파이프라인은 수동 정량화와 마찬가지로 형광을 정확하게 정량화합니다. 녹색 형광염료 BODIPY와 지질 방울 함량을 고정 하고 염색한 젊은 성인 웜의 형광 정량화의 비교는 Worm_CP파이프라인(A)또는 수동 정량화(B)를 사용합니다. WT 및 dbl-1(nk3)의 지질 방울 함량은 지질 방울의 지방산으로 인터카로 삽입되는 BODIPY로 동물을 고정하고 염색하여 모니터링되었습니다(프로토콜 A 참조). 젊은 성인 동물은 60 %의 이소 프로파놀로 고정되었고 1 시간 동안 BODIPY로 얼룩졌습니다. 동일한 동물 세트는 Worm_CP 파이프라인(7단계 참조)을 사용하거나 표준절차(17)에따라 수동 정량화하여 정량화하였다. (a)Worm_CP 파이프라인을 이용한 형광의 정량화. WT: n=22 동물, 평균 형광 = 1.016 (A.U) ± 0.206 SD; dbl-1 (nk3):n=25 동물, 평균 형광 = 0.8714 (A.U) ± 0.126 SD. 미페어링 T-테스트. (B) 형광의 수동 정량화. WT: n=22 동물, 평균 형광 = 1.048 ± 0.153 SD; dbl-1 (nk3): n =25 동물, 평균 형광 = 0.8632 ± 0.109 SD. 미페어링 t-테스트. (C, D) WT(C)및 dbl-1(nk3) (D)동물에 대한 대표적인 예 또는 웜-정렬 출력이 웜 정렬 파이프라인으로 곧게 된다. 이미지는 녹색 형광 강도 =2, 노출 = 60ms와 반전 된 와이드 필드 현미경 (재료 테이블 참조)에 20 배 목표로 촬영했다.
도 7: 전사 기자 hsp-70(C12C8.1)p::GFP 다음 열 충격을 운반하는 살아있는 벌레의 형광 이미지로부터 의 형광 정량화 및 실시간 웜정렬의 예. (A)짧은 열 충격(34°C에서 30분) 경상수지에서 젊은 성인 벌레를 재배 온도(25°C)에서 회수한 다음 3.5시간 후 열 충격을 이미지화하였다. 웜 정렬 파이프라인을 사용하여 열 쇼크 후 약 30개의 웜이 정량화되었습니다. (A-B) 열 충격에 노출되지 않은 정렬 된 웜의 예입니다. (C-D) hsp-70(C12C8.1)p::GFP를 사용하여 웜 정렬을 운반하는 열 충격 웜의 예. (E)열 충격없이 또는 열 충격 (30 분 동안 34 °C)에 노출시 성장 한 WT 젊은 성인 웜의 GFP 평균 강도 (Worm_CP 매개 변수 : MeanIntensity_Threshold)를 나타낸다. 이미지는 녹색 형광 강도 =1, 노출 = 60ms와 반전 된 광야 현미경 (재료 테이블 참조)에 20 배 의 목표로 촬영했다; HS 없음: n=12, HS: n=32. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: 웜 정렬 매크로를 찾을 수 있는 피지의 위치, 일단 설치. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 2: 동일한 설정으로 촬영한 모든 이미지가 포함된 폴더 선택입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 3: 피지의 출력 폴더에 4 개의 하위 폴더의 생성. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 4: 몽타주에 대한 웜 및 채널 설정의 폭을 가로 질러 선의 그리기. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 5: 적용된 설정으로 이미지 미리 보기입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 6: 몽타주 및/또는 정량화에 포함하기 위한 관심 있는 벌레의 세로축을 따라 선을 그립니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 7: "정렬된" 폴더 아래 출력 폴더에 선택한 웜의 몽타주. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 8: 셀 프로파일러의 이전 분석에서 이전 이미지를 지우기. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 9: 설정.csv 하위 폴더를 선택하여 웜 정렬 출력 폴더에서 셀 프로파일러로 메타데이터를 가져옵니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 도 10: CellProfiler 파이프라인 Worm_CP.cpproj는 Lines_ 이미지를 사용하여 선택한 웜(A)을 단일화하고 관심 있는 웜(C)의 단일 웜 마스크를 생성합니다. 파이프라인은 배경 강도(B)를 측정합니다. csv 파일(D)으로 내보내는 파이프라인 Worm_CP.ccproj에서 측정한 모든 매개 변수의 전망입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 11: Worm_CP.cpproj 파이프라인의 "ExportToSpreadsheet"에서 출력 파일 선택. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
웜 정렬은 시각적 비교, 분류 및 표현을 돕기 위해 웜을 곧게 펴고 정렬하는 사용자 선택 웜의 몽타주를 쉽게 생성하는 FIJI 기반 이미지 처리 파이프라인입니다. 이 기능은 셀 프로파일러7의웜툴박스 모듈과 같은 일부 기존 도구에도 제공되지만 웜 정렬은 비교적 적은 이전 이미지 분석 경험이 필요합니다. 원시 이미지 데이터의 웜을 추적하는 것은 쉬운 과정이지만 특히 터치 스크린 컴퓨터 또는 태블릿을 사용할 수 있는 경우 해당 선이 웜의 세로 축을 따라 올바르게 그려집니다. 웜의 일부만 따르는 불완전한 선은 CellProfiler 분석 중에 몽타주에 부분 적인 벌레(즉, 꼬리 끝의 머리가 누락된 벌레)와 부분 분할 마스크를 생성합니다. 또한, 두 개의 개별 웜의 선이 교차하는 경우, 웜은 형광 정량화뿐만 아니라 웜 정렬 몽타주에서 올바르게 처리되지 않습니다. 품질 관리를 위해 원본 이미지의 라인 선택 의 오버레이 이미지가 QC 테이블과 함께 데이터 폴더에 저장됩니다. 이러한 것에서 잘못 분할된 웜으로 이어지는 문제가 있는 선은 몽타주 및/또는 후속 분석에서 쉽게 식별하고 제외될 수 있습니다.
벌레의 선택에 있는 실험자의 직접적인 입력은 아마 약간 시간이 소요되는 것처럼 보이지만, 다른 발달 단계의 웜이 동일한 이미지에 존재하는 실험에서 다른 사람들보다 워크플로우의 명확한 이점을 제공합니다: 웜은 올바른 발달 단계에 있는 그 웜만을 요약하여 "추적 단계"동안 선택할 수 있습니다. 또는, 웜은 추적 선의 길이 또는 분할 마스크의 면적에 따라 Worm_CP 출력을 사용하여 필터링할 수 있으며, 둘 다 웜의 길이/크기의 신뢰할 수 있는 지표입니다. 틀림없이, 기계 학습 알고리즘은 DIC 이미지의 크기와 모양이 너무 다르기 때문에 다른 발달 단계에서 웜을 인식하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.
웜 정렬의 출력은 피지 또는 다른 이미지 분석 소프트웨어 플랫폼에서 단일 웜에서 형광 강도의 후속 정량화에 사용할 수 있습니다. 웜 정렬 출력을 웜 정렬 파이프라인을 실행하는 동안 선택한 개별 웜에서 다중 채널 형광 강도의 정량화를 허용하는 간단한 CellProfiler 파이프라인(Worm_CP)으로 가져와 이를 입증했습니다. 우리는 CellProfiler 소프트웨어의 유연성 때문에 이 접근 방식을 선택했습니다: 개별 벌레의 추가 특징을 분석하기 위해 파이프 라인에 추가 모듈을 통합하는 것은 간단합니다 (예 : 지질 방울의 크기 측정, 또는 스트레스 과립, 핵, 미토콘드리아). 또한 단일 웜 마스크는 웜툴박스7에대한 새 모델을 학습하는 데 잠재적으로 사용될 수 있습니다.
이 방법의 주요 장점은 빠르며 간단한 웜 장착 설정이 필요하다는 것입니다. 이 방법은 머신 알고리즘7을통해 소프트웨어 작업을 학습하거나 교육 세트를 실행하는 데 시간을 할애할 필요가 없기 때문에 빠릅니다. 또한 이 방법은 일반 아가로즈 패드에 단순히 장착된 라이브 또는 고정 웜과 함께 작동합니다. 다른 방법으로 개발 된 복잡한 미세 유체 챔버를 사용할 필요가 없습니다5,6.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 BIOCEV (프라하, 체코)의 크리스티안 랑코트 박사에게 고정 된 벌레를 장착하는 입 마이크로 파이프 기술을 가르쳐 준 크리스티안 랑토트 박사와 파티마 산토스 박사와 데비 드라게 박사가 입 마이크로 파이프에 안전 설정을 공유한 것에 대해 감사드립니다. 우리는 또한 그들의 지원에 대한 원고, 샬린 머독과 Babraham 연구소 시설을 편집 프란체스카 호지 감사합니다. OC는 ERC 638426 및 BBSRC [BBS/E/B000C0426]에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | MeLford Biolaboratories Ltd | MB1200 | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Beaker | |||
| BODIPY 493/593 | Invitrogen | D3922 | stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL |
| Centrifuge | MSE MISTRAL 1000 | ||
| Conical flask | |||
| Cover Slip | VWR | 631-0120 | |
| Filter 0.2 µm for Syringe | Sartrius | 16534-K | Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Isopropanol | |||
| Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | BP212 | 3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9 |
| Liquid Nitrogen | Liquid Nitrogen facility | ||
| Low Retention Tip 1000µL | Starlab | S1182-1830 | |
| Methanol | VWR chemicals | 20847.307 | |
| Microscope Slides, MENZEL GLASSER | Thermo Scientific | BS7011/2 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microwave Oven | Delongi | ||
| M9 | prepared in the lab according to15 | ||
| 9cm NGM Plates | prepared in the lab according to15 | ||
| PBS | prepared in the lab | ||
| Protein LoBind Tube 2ml | Eppendorf | 22431102 | |
| Triton | SIGMA | T9284-500ML | |
| Ring Caps | SIGMA-ALDRICH | Z611247-250EA | glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Rotator | Stuart Scientific | ||
| Silicone tubine translucent | Scientific Laboratory Suppliers | TSR0600200P | 6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Sterilized H2O | MilliQ water autoclaved in the lab | ||
| 10µL Tips | Starlab | S1120-3810 | |
| 200µL Tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 1000µL Tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 15mL Centrifuge Tube | CORNING | 430791 | |
| Vecta Shield | VECTOR | 94010 | antifade mounting medium (H-1000) without DAPI |
References
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