Summary
يتم تقديم بروتوكول لمنع تدفق اللمفية عن طريق خياطة جراحية من الأوعية اللمفاوية afferent.
Abstract
الأوعية اللمفاوية حاسمة في الحفاظ على توازن سوائل الأنسجة وتحسين الحماية المناعية عن طريق نقل المستضدات، السيتوكينات، والخلايا إلى استنزاف الغدد الليمفاوية (LNs). انقطاع تدفق اللمفية هو وسيلة هامة عند دراسة وظيفة الأوعية اللمفاوية. الأوعية اللمفاوية الموفاوية من اللوحات اللمفية المورين إلى الغدد الليمفاوية الزفيرة (pLNs) هي محددة جيداً على أنها الطرق الوحيدة لتصريف الغدد الليمفاوية في النفصال. يمكن خياطة هذه الأوعية اللمفاوية afferent منع تدفق اللمفية بشكل انتقائي إلى pLNs. هذه الطريقة تسمح للتدخل في تدفق الليمفاوية مع الحد الأدنى من الضرر للخلايا البطانية اللمفاوية في التصريف pLN، والأوعية اللمفاوية afferent، فضلا عن غيرها من الأوعية اللمفاوية في جميع أنحاء المنطقة. وقد استخدمت هذه الطريقة لدراسة كيفية تأثير اللمفية على النفّة الغدد الليمفاوية العالية (HEV) والتعبير chemokine في LN، وكيف تتدفق اللمفية من خلال الأنسجة الدهنية المحيطة LN في غياب الأوعية اللمفاوية الوظيفية. مع الاعتراف المتزايد لأهمية وظيفة اللمفاوية، وسوف يكون لهذه الطريقة تطبيقات أوسع لزيادة كشف وظيفة الأوعية اللمفاوية في تنظيم البيئة الدقيقة LN والاستجابات المناعية.
Introduction
يوفر التنظيم المكاني للنظام اللمفاوي الدعم الهيكلي والوظيفي لإزالة السوائل خارج الخلية ومضادات النقل والخلايا التي تقدم المستضدات (APCs) إلى LNs المستنزفة. الأوعية اللمفاوية الأولية (تسمى أيضا الشعيرات الدموية اللمفاوية) هي نفاذية للغاية بسبب تقاطعاتها بين الخلايا غير المترابطة ، والتي تسهل جمع فعال من السوائل والخلايا وغيرها من المواد من المساحات خارج الخلية المحيطة1. الأوعية اللمفاوية الأولية دمج في جمع الأوعية اللمفاوية، والتي لديها تقاطعات ضيقة بين الخلايا، وغشاء الطابق السفلي المستمر، وتغطية العضلات اللمفاوية. جمع الأوعية اللمفاوية هي المسؤولة عن نقل اللمف التي تم جمعها إلى LNs استنزاف والعودة في نهاية المطاف الليمفاوية إلى الدورة الدموية2،3. والأوعية اللمفاوية جمع التي تدفع الليمفاوية في LN استنزاف هي الأوعية اللمفاويةafferent 4,5,6,7. يمكن عرقلة الأوعية اللمفاوية afferent منع تدفق اللمفية في LNs، وهو أسلوب مفيد عند دراسة وظيفة تدفق الليمفاوية.
وقد أظهرت الدراسات السابقة أن تدفق اللمفية يلعب دورا هاما في نقل المستضدات و APCs، فضلا عن الحفاظ على التوازن LN. ومن المفهوم جيدا أن المركبات المضادة للأفراد المشتقة من الأنسجة، التي تنشط عادةً الخلايا التشعبية المهاجرة (DCs)، تنتقل عبر الأوعية اللمفاوية المنتقلة إلى LN لتنشيط الخلايا التائية8. فكرة أن مستضدات حرة الشكل، مثل الميكروبات أو المستضدات القابلة للذوبان، تدفق سلبي مع الليمفاوية إلى LN لتنشيط LN المقيم APCs وقد تم الحصول على القبول في العقد الماضي9،10،11،12. مستضدات الشكل الحر السفر مع الليمفاوية يستغرق دقائق بعد العدوى للسفر إلى LN، وتفعيل الخلية المقيم LN قد تحدث في غضون 20 دقيقة بعد التحفيز. هذا هو أسرع بكثير من تفعيل DCs المهاجرة ، والتي تأخذ أكثر من 8 ح لدخول 9LNاستنزاف . بالإضافة إلى نقل المستضدات لبدء الحماية المناعية ، تحمل اللمفية أيضًا السيتوكينات وCS إلى LN للحفاظ على البيئة الدقيقة ، ودعم الخلايا المناعية13،14. سابقا، منع تدفق اللمفية عن طريق خياطة الأوعية اللمفاوية afferent أظهرت أن الليمفاوية مطلوب للحفاظ على النمط الظاهري HEV المطلوبة لدعم خلية T homeostatic وB خلية توجيه إلى LN15،16،17. CCL21 هو chemokine الحرجة التي توجه DC و T الخلية تحديد المواقع في LN8،18. حظر تدفق اللمفية يقطع تعبير CCL21 في LN ومن المحتمل أن ينقطع DC و T الخلية تحديد المواقع و/أو التفاعل فيLN 19. وهكذا، يمكن حظر تدفق الليمفاوية بشكل مباشر أو غير مباشر إلغاء مستضد / DC الوصول إلى LN استنزاف عن طريق تعطيل البيئة الدقيقة LN التي تنظم الاستجابات المناعية في LN. لتحقيق أفضل وظيفة تدفق الليمفاوية، يتم تقديم بروتوكول تجريبي (الشكل 1) لمنع تدفق اللمفية في الفئران عن طريق خياطة الأوعية اللمفاوية afferent من لوحة القدم إلى pLN. يمكن أن تكون هذه الطريقة تقنية مهمة للدراسات المستقبلية حول وظيفة اللمفاوية في الحالات الصحية والمُرضى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يجب أن يتم اعتماد جميع الأعمال الحيوانية من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية والحكومية ومناولة الحيوانات. هذه جراحة غير نجاة
1- إعداد المواد
- إعداد 100 مل من 70٪ الإيثانول عن طريق خلط 70 مل من 100٪ الإيثانول مع 30 مل من الماء المعقم. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية قبل الجراحة والحفاظ على الأدوات في 70٪ الإيثانول قبل وأثناء الجراحة للحفاظ على التعقيم.
- إعداد جهاز حقن.
- قطع ~ 30 سم من أنابيب البولي إيثيلين (0.28 ملم في القطر). قم بتوصيل طرف إبرة 30 G × 1/2 (إبرة A) إلى طرف واحد من أنابيب البولي إيثيلين. طرد بعناية آخر 30 G × 1/2 إبرة (إبرة B) وربط الجانب المكسور إلى الطرف الآخر من أنابيب البولي إيثيلين.
- إرفاق إبرة A إلى حقنة 1 مل درنة.
ملاحظة: لهذا أنابيب البولي إيثيلين، 1.6 سم من السوائل في الأنابيب يتوافق مع 1 μL20.
- إعداد 10:1 الكيتامين / الزيلازين خليط (10 ملغ / مل الكيتامين و 1 ملغم / مل xylazine) في المالحة (bacteriostatic 0.9 ٪ [ث / الخامس] كلوريد الصوديوم). إعداد الحل حديثا قبل الاستخدام.
2. إعداد الحيوان للجراحة
ملاحظة: استخدام الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 6-10 أسابيع. ويمكن استخدام الفئران الإناث والذكور على حد سواء. في هذه الدراسة، تم استخدام فئران الإناث C57BL/6 البالغة من العمر 6-10 أسابيع. يمكن تكييف هذه الطريقة لسلالات أخرى من الفئران.
- تخدير الماوس عن طريق حقن 250 ميكرولتر من خليط الكيتامين /زيلازين intraperitonally. انتظر حتى يكون الماوس نائما تماما. تأكد من عدم تفاعل الماوس مع قرصة إصبع الية للكشف عن التخدير الكامل.
- حلاقة الفراء حول الساقين مع قصات الشعر.
- ضعي كريم إزالة الشعر حول الساق وانتظري لمدة 5 دقائق. مسح قبالة الفراء المتبقية وكريم إزالة الشعر باستخدام الأنسجة الرطبة وتنظيف الساق مع الماء المعقم. رش 70٪ الإيثانول حول الساق لتعقيم منطقة العمليات. الإيثانول مقتصر على موقع الشق.
3. خياطة الجراحية من الأوعية اللمفاوية afferent
ملاحظة: يتم خياطة الساق اليمنى، ويتم استخدام الساق اليسرى كتحكم زائف. بروتوكول الغرز اللمفاوي (الخطوات 3.1−3.8) يأخذ 20−30 دقيقة.
- إبقاء الماوس في موقف عرضة وإصلاحه مع الشريط الجراحي لفضح منطقة العملية على الساق اليمنى.
- إيندرماally حقن 5 ميكرولتر من 1٪ صبغة زرقاء إيفانز أو 9 سم من السائل من جهاز الحقن أنابيب في القدم. تدليك بلطف لوحة القدم لمساعدة ايفانز الأزرق دخول الأوعية اللمفاوية.
ملاحظة: حقنة الأنسولين ليس من السهل السيطرة على حقن حجم صغير. يمكن التحكم في وحدة التخزين بشكل أكثر دقة باستخدام جهاز الحقن. يتم تصور الأوعية اللمفاوية عن طريق الصبغة الزرقاء تحت الجلد. مع التدريب المكثف، يمكن رؤية كل من الأوعية اللمفاوية المهذبة بالعين المجردة كأوعية شفافة في الأنسجة الدهنية، بالتوازي مع الشريان الصابف. مع تدريب واسع النطاق، فمن الممكن خياطة السفن دون حقن صبغة زرقاء ايفانز في الحالات التي توجد فيها مخاوف من اضطرابات محتملة من الصبغة. - تحت مجهر تشريح، واختيار موقع شق 5 ملم من الحافة السفلية من فوسا popliteal. جعل شق صغير (~ 5 مم) في الجلد مع مقص. باستخدام ملقط عملية غرامة، وتمتد شق، وفضح الأوعية اللمفاوية جمع (الشكل 1A).
ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن إزالة جزء صغير من الجلد للكشف عن الأوعية اللمفاوية. - تحديد كل الأوعية الليمفاوية afferent المؤدية إلى pLNs تحت المجهر تشريح (الشكل 1B).
ملاحظة: هناك اثنين من الأوعية اللمفاوية afferent من لوحة القدم إلى pLN. كلاهما بحاجة إلى أن تكون خياطة لمنع تدفق الليمفاوية تماما. - باستخدام حامل إبرة، أدخل بحذر إبرة الغرز (0.7 متري أو أصغر) بين الأوعية اللمفاوية الوريدية والشريان الصابف وسحب الإبرة برفق حول الأوعية اللمفاوية afferent. سحب سلسلة خياطة بلطف وترك حوالي 2 سم من سلسلة خياطة وراء. استخدام حامل إبرة للمساعدة في ربط سلسلة بإحكام لخياطة وعاء واحد الليمفاوية مع عقدة الجراح (الشكل 1C).
ملاحظة: قد يجف النسيج تحت الشق مع التعرض لفترات طويلة للهواء. جعل شق صغير قدر الإمكان وأداء خياطة بسرعة (أي، في غضون 5 دقائق) سيمنع الأنسجة من الجفاف. الحفاظ على رطوبة الأنسجة عن طريق تطبيق كمية صغيرة من المالحة مع مسحة القطن. - تدليك بلطف لوحة القدم لضمان عدم وجود صبغة زرقاء ايفانز يمر موقع خياطة ومن ثم قطع السلسلة الزائدة مع مقص.
- قم بإجراء نفس الخطوات الرزية (أي، الخطوتين 3.5 و3.6) على الوعاء اللمفاوي الآخر(الشكل 1D). أغلق شق الجلد بنفس الغرزة التي تم استخدامها لخياطة الأوعية في الخطوة 3.5 (الشكل 1E).
- للسيطرة صورية، intradermally حقن 5 ميكرولتر من 1٪ ايفانز صبغة زرقاء في القدم الأيسر وتدليك لوحة القدم لتصور الأوعية اللمفاوية. افتح الجلد مع استئصال ثم أغلق الجرح دون خياطة الوعاء (الشكل 1F).
- اختياريا، مراقبة الفئران التي تعمل لمدة 2-4 ساعة. يجب أن يظهر جانب الغرز من الساق وذمة مع انتشار إيفانز بلو إلى الفخذ ، في حين أن ساق التحكم ستظهر صبغة زرقاء مقيدة لإيفانز في لوحة القدم. إذا يقظت الفئران، سيتم حقن مزيج إضافي من الكيتامين/الزيلازين للحفاظ على التخدير حتى القتل الرحيم.
4. تتبع تدفق الليمفاوية
- مباشرة بعد الجراحة، حقن intradermally 10 ميكرولتر من 2٪ fluorescein isothiocyanate (FITC) في لوحة القدم لكل من السيطرة والساق خياطة اللمفاوية.
- القتل الرحيم الفئران مع 400 ميكرولتر من خليط الكيتامين / xylazine وإجراء خلع عنق الرحم عندما يتم تخدير الفئران بالكامل.
- جمع pLNs من fossa popliteal وإزالة بعناية الأنسجة الدهنية perinodal حول pLNs تحت مجهر تشريح في 2, 6, و 12 ح بعد حقن فيت.
- تضمين pLNs مع منطقة الجيوب الأنفية النخاعية النخاعية التي تواجه إلى جانب cryomold في درجة حرارة القطع المثلى (أكتوبر) مركب(الشكل 1G, H).
- إعداد 20 ميكرومتر أقسام مجمدة باستخدام cryotome.
- صورة عمليات التشريب تحت مجهر الدمج لتحديد توزيع FITC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استخدمت خياطة الأوعية اللمفاوية في الدراسات السابقة15,16,17,19, حيث كان بمثابة أداة هامة لدراسة وظيفة تدفق الليمفاوية قبل علم الأحياء الجزيئية لالأوعية اللمفاوية كان مفهوما بشكل أفضل. حظر تدفق اللمفية يقطع التوازن LN، الأمر الذي يؤدي إلى فقدان HEVs التعبير الجيني الحرجة اللازمة للمعالجة الليمفاوية الأمثل إلى LN15،16،17. ومنذ ذلك الحين، استغرق الأمر عقدين آخرين لإثبات أن البلدان النامية السفر مع الليمفاوية حاسمة في الحفاظ على ملف تعريف التعبير الجيني HEV واللمفاوية توجيه إلى LN13. الإجهاد القص المقدمة من تدفق الليمفاوية أمر بالغ الأهمية لتحفيز تعبير chemokine في LN. حظر تدفق اللمفية يقطع chemokine CCL21 التعبير في LN19، وهو أمر بالغ الأهمية في توجيه DC و T الخلية تحديد المواقع في LN. لذلك، قد يؤدي انقطاع تدفق تسوية DCs والخلايا التائية تحديد المواقع في LN8،18.
مباشرة بعد الجراحة، تم استخدام جهاز تتبع فلوري صغير الوزن الجزيئي، FITC، لتتبع التدفق اللمفاوي. تم حقن FITC (10 ميكرولتر من 2٪ FITC) داخل الجلد في لوحة القدم من السيطرة الصورية والساق خياطة اللمفاوية. تم جمع pLNs استنزاف 2، 6، و 12 ساعة في وقت لاحق. تم تضمين الـ pLNs المستنزفة في أكتوبر ، وتم إعداد أقسام مجمدة 20 ميكرومتر. وأظهرت الصور Confocal انخفاض كبير في تراكم FITC في pLNs بعد خياطة. أما المتبقية فيت في النت في النتفات قد تراكمت بشكل تفضيلي في الجيوب الأنفية LN(الشكل 2).
كيف التدفقات الليمفاوية من خلال الأنسجة الدهنية المحيطة LN تم التحقيق باستخدام خياطة اللمفاوية. الأوعية اللمفاوية afferent المؤدية إلى pLNs كانت خياطة لمنع تدفق اللمفية، وتقرر أن الأنسجة الدهنية فينودال يمكن أن تدعم كمية صغيرة من تدفق الليمفاوية عندما تم حظر الأوعية اللمفاوية21. تم تعيين تدفق الليمفاوية من خلال الأنسجة الدهنية إلى كبسولة LN; يبدو أن تغذى في الجيوب الأنفية LN. قد تدفقت كميات صغيرة من اللمف في الجيوب الأنفية LN مع مرور الوقت (الشكل 3).
الشكل 1: خطوات من LN (pLN) خياطة الأوعية اللمفاوية afferent. لفترة وجيزة ، بعد تخدير الفئران بخليط الكيتامين والزيلازين ، حلقت أرجلها ، وأزيل الفراء المتبقي من كريم إزالة الشعر. تم استخدام الساق اليمنى للخياطة والساق اليسرى كانت السيطرة الزائفة. تم حقن الجانب الأيمن من لوحة القدم داخل الجلد مع 5 ميكرولتر من 1٪ صبغة زرقاء إيفانز المعدة في PBS. (أ) عن طريق تدليك بلطف على الاقدام ، ايفانز الأزرق صبغة شغل الأوعية اللمفاوية afferent. (ب) تم إجراء قطع الجلد الصغير 5 مم بعيدا عن pLN لفضح الأوعية اللمفاوية ، والتي يشار إليها من قبل الأسهم البيضاء اثنين. (C,D) كلا الأوعية اللمفاوية المهترة كانت مُزخرقة (E) تم إغلاق ختان الجلد بواسطة الغرز. (F)تلقى الساق التحكم إيفانز حقن الأزرق, استئصال الجلد, وإغلاق خياطة دون خياطة الأوعية اللمفاوية. (G) تم الإشارة إلى نجاح انسداد التدفق اللمفاوي من قبل صبغة زرقاء إيفانز ، والتي دخلت pLN من الساق التحكم ولكن ليس الساق خياطة. (H، أنا) كانت جزءا لا يتجزأ من pLNs التي تم جمعها في مركب أكتوبر مع الجيوب الأنفية الفرعية (SCS) والجيوب النخاعية النخاعية (MS) التي تواجه جانب البرد قبل الارتزاء في النيتروجين السائل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توزيع فيت في pLNs استنزاف من الساق وهمية أو خياطة. الصور Confocal من pLNs جمعت 2 و 6 و 12 ساعة بعد حقن فيتف أظهرت انخفاض كبير في تراكم FITC في pLNs بعد خياطة. تم العثور على FITC المتبقية في pLNs بشكل تفضيلي في الجيوب الأنفية LN. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توزيع فيت في الأنسجة الدهنية (PAT) ، حول pLNs استنزاف من الساق وهمية أو خياطة. وأظهرت الصور Confocal من بات وLN أن فيتف يدخل بات والجيوب الأنفية LN ولكن لم يتم توزيعها بشكل فعال في جميع أنحاء LN عندما تم حظر الأوعية اللمفاوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سيكون لحجب تدفق اللمفية تطبيقات واسعة في معالجة تسليم المستضد إلى LN في ظروف صحية ومريضة. من الممكن استخدام هذه الطريقة للتحكم في توقيت تسليم المستضد من أجل دراسة كيفية استمرار تدفق الليمفاوية ينظم الاستجابة المناعية في استنزاف LNs. ويمكن أيضاً استخدام هذه الطريقة لانقطاع تدفق اللمفية لدراسة كيفية تأثير اللمفاوة على تجزئة الخلية، وتنشيط الخلية، وترحيل الخلايا، وتفاعلات الخلايا الخلوية في LN.
الفئران على وجه التحديد التعبير عن مستقبلات السم الخناق البشري (DTR) في الخلايا البطانية الليمفاوية(Flt4-cre-dtr)وقد وضعت; ويمكن استخدام هذه خصيصا لنضوب الأوعية اللمفاوية لدراسة وظيفة اللمفية22. إدارة DT يقتل الخلايا البطانية اللمفاوية على طول الأوعية اللمفاوية وفي LN. يمكن أن يؤدي استنفاد الخلايا البطانية اللمفاوية إلى إلغاء تدفق اللمف بشكل كامل إقليميًا أو بشكل نظامي لدراسة الوظيفة اللمفاوية. هذه الطريقة تسبب تراكم السوائل كبيرة في الأنسجة، ويعمل كنموذج كبير لدراسة الوذمة اللمفاوية وظيفة اللمفاوية.
بالمقارنة مع الخلايا البطانية اللمفاوية الخاصة بنموذج التعبير DTR، وميزة طريقة الغرز اللمفاوية هو أنه يقطع تدفق الليمفاوية مع الحد الأدنى من الضرر إلى الخلايا البطانية الليمفاوية أو أي وعاء اللمفاوية الأخرى في جميع أنحاء المنطقة. التدخل لا يؤثر بشكل مباشر على الخلايا في LN استنزاف، وبالتالي فإن التأثير الناتج على البيئة الدقيقة LN أو الاتصال الخلايا المناعية هو نتيجة لحصار تدفق الليمفاوية بدلا من موت الخلايا المحتملة الناجمة عن DT. فائدة أخرى من هذه الطريقة هي أن تدفق اللمفية يتم حظره على الفور بعد الجراحة ، لذلك يمكن التحكم في توقيت حصار التدفق اللمفاوي بشكل أفضل.
الحد من هذه الطريقة هو أنه لا يمكن إلا أن تستخدم لدراسة التدخل الإقليمي لتدفق الليمفاوية في الأوعية الليمفاوية afferent من مهبط القدمين إلى pLN. هذه الطريقة تحتاج إلى تحديد الموقع الدقيق للسفن اللمفاوية جمع. جمع الأوعية اللمفاوية من الصعب تحديد في بعض المواقع التشريحية، وبالتالي هذه التقنية يتطلب التدريب التشريحي والجراحي واسعة النطاق قبل تحديد ناجحة من الأوعية اللمفاوية لمنع تدفق الليمفاوية. وثمة قيد آخر هو أن هذه الطريقة لا يمكن أن تمنع مباشرة الليمفاوية دخول الأوعية اللمفاوية الأولية. بعد الغرز، قد يؤدي التدفق الليمفاوي المسدود المسدود إلى زيادة ضغط السائل الخلالي وتغيير اتجاه التدفق اللمفاوي في الأوعية اللمفاوية الأولية. وهكذا، قد تعوض الأوعية اللمفاوية السليمة حول المنطقة عن وظيفة الأوعية اللمفاوية المتقطعة وتغير اتجاه التدفق اللمفاوي.
وعلاوة على ذلك، فإن حقن صبغة ايفانز الأزرق يزيد من ضغط السائل الخلالي، والتي قد تتداخل مع التتبع اللاحقة أو حقن المستضد. قد يتداخل الفلوروس من صبغة إيفانز الزرقاء مع أجهزة تتبع الفلورسنت الأخرى أو الفلوروفورات الأخرى المستخدمة في تلطيخ الفلوروست المناعي. لتجنب أي تفاعل بين صبغة ايفانز الأزرق والمستضدات المحتملة، التتبعات الأخرى، أو الآليات الجزيئية المحتملة لتنظيم وظيفة اللمفية، فمن الممكن لتحديد الأوعية اللمفاوية جمع دون صبغة الأزرق ايفانز بالعين المجردة. ويمكن تحقيق ذلك من خلال التدريب المكثف لتحديد السفن. الأصباغ الأخرى، مثل صبغة زرقاء isosulfan يمكن أيضا أن تستخدم لتحل محل صبغة الأزرق إيفانز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون آفا زاردينشاد على تدقيقها في المخطوطة. ويدعم هذا العمل المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR، PJT-156035)، والمؤسسة الكندية للابتكار من أجل SL (32930)، والمؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية ليوخيا لين (81901576).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
- Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
- Schmid-Schonbein, G. W.
- Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
- Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
- Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
- Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
- Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
- Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
- Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
- Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
- Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
- Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
- Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
- Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
- Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).
- Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
- Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).
