In Vivo Kwantificering van eiwitomzet in Aging C. Elegans met behulp van Photoconvertible Dendra2
Summary
Hier gepresenteerd is een protocol om de afbraak van het eiwit huntingtine gefuseerd aan de fotoconvertible fluorophore Dendra2 te controleren.
Abstract
Eiwitten worden voortdurend gesynthetiseerd en afgebroken in een cel om homeostase te behouden. In staat zijn om de afbraak van een eiwit van belang te controleren is de sleutel tot het begrijpen van niet alleen de levenscyclus, maar ook om onevenwichtigheden in het proteostasenetwerk aan het licht te brengen. Deze methode laat zien hoe de afbraak van het ziekteverwekkende eiwit huntingtine kan worden gevolgd. Twee versies van huntingtine gefuseerd tot Dendra2 worden uitgedrukt in het C. elegans zenuwstelsel: een fysiologische versie of een met een uitgebreide en pathogene strook glutamines. Dendra2 is een fotoconverteerbaar fluorescerend eiwit; op een korte ultraviolette (UV) bestraling puls, Dendra2 schakelt zijn excitatie / emissie spectra van groen naar rood. Net als bij een pulse-chase experiment, kan de omzet van de omgebouwde red-Dendra2 worden gecontroleerd en gekwantificeerd, ongeacht de interferentie van nieuw gesynthetiseerd groen-Dendra2. Met behulp van confocale microscopie en door de optische transparantie van C. elegansis het mogelijk om de afbraak van huntingtine-Dendra2 in een levend, ouder wordend organisme te monitoren en te kwantificeren. Neuronale huntingtine-Dendra2 wordt kort na de conversie gedeeltelijk afgebroken en in de loop van de tijd verder gewist. De systemen die de afbraak beheersen zijn ontoereikend in aanwezigheid van mutant huntingtine en worden verder aangetast door veroudering. Neuronale subtypes binnen hetzelfde zenuwstelsel vertonen verschillende omzetcapaciteiten voor huntingtine-Dendra2. Over het algemeen kan het monitoren van een eiwit dat met Dendra2 is gesmolten, belangrijke informatie opleveren, niet alleen over de degradatie en de spelers van het betrokken proteostasenetwerk, maar ook over de locatie, de handel en het vervoer ervan.
Introduction
Het proteoom van een levend organisme vernieuwt zichzelf voortdurend. Eiwitten worden voortdurend afgebroken en gesynthetiseerd volgens de fysiologische vraag van een cel. Sommige eiwitten worden snel geëlimineerd, terwijl andere langer worden geleefd. Het monitoren van eiwitdynamica is een eenvoudigere, nauwkeurigere en minder invasieve taak bij het gebruik van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten (FPs). FPs vormen auto-katatisch en kunnen worden gefuseerd tot elk eiwit van belang (POI), maar vereisen geen enzymen te vouwen of cofactoren nodig, behalve voor zuurstof1. Een nieuwere generatie FPs is onlangs ontworpen om kleur te schakelen op bestraling met een lichtpuls van bepaalde golflengte. Deze fotoactivatable FPs (PAF’s) maken het mogelijk om POI’s, organellen of cellen waarin ze zich bevinden, te labelen en bij te houden, en om hun kwantitatieve en/of kwalitatieve parameters te onderzoeken2. FPs maken het mogelijk om elke POI’s beweging, directionaliteit, snelheid van beweging, coëfficiënt van diffusie, mobiele versus onbeweeglijke breuken, de tijd dat het zich in een cellulair compartiment, evenals de omloopsnelheid. Voor specifieke organellen kunnen bewegings- en transport- of splijtings- en fusiegebeurtenissen worden bepaald. Voor een bepaald celtype kunnen de positie, de verdelingssnelheid, het volume en de vorm van een cel worden vastgesteld. Cruciaal is dat het gebruik van PAFP’s tracking mogelijk maakt zonder continue visualisatie en zonder interferentie van een nieuw gesynthetiseerde sonde. Studies zowel in cellen als in hele organismen hebben met succes PAFP’s gebruikt om biologische vraagstukken in vivo aan te pakken, zoals de ontwikkeling van kanker en metastase, assemblage of demontage van het cytoskelet en RNA-DNA/eiwit interacties3. In dit manuscript worden lichtmicroscopie en PAFP’s gebruikt om de omloopsnelheid van het aggregatiegevoelige eiwit huntingtine (HTT) in vivo bloot te leggen in een C. elegans-model van neurodegeneratieve ziekte.
Het hier beschreven protocol kwantificeert de stabiliteit en afbraak van het fusie-eiwit huntingtine-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 is een monomerieke PAFP4 van de tweede generatie die zijn emissie/excitatiespectra onomkeerbaar schakelt van groen naar rood in reactie op UV of zichtbaar blauw licht, met een toename van de intensiteit tot 4.000-voudig5,6. Huntingtine is het eiwit dat verantwoordelijk is voor het veroorzaken van de ZvH, een fatale erfelijke neurodegeneratieve aandoening. Huntingtine exon-1 bevat een stuk glutamines (CAG, Q). Wanneer het eiwit wordt uitgedrukt met meer dan 39Q, het misfolds in een mutant, giftig en pathogene eiwit. Mutant HTT is gevoelig voor aggregatie en leidt tot neuronale celdood en degeneratie, hetzij als korte oligomerische soorten of als grotere zeer gestructureerde amyloïden7.
De nematode is een modelsysteem voor het bestuderen van veroudering en neurodegeneratie dankzij het gemak van manipulatie, isogene aard, korte levensduur, en de optische transparantie8. Om de stabiliteit van HTT in vivo te bestuderen, werd een fusieconstructie uitgedrukt in het zenuwstelsel van C. elegans. Een HTT-D2 transgene met ofwel een fysiologische stretch van 25Qs (HTTQ25-D2) of een pathologisch traject van 97Qs (HTTQ97-D2) is overexpressed pan-neuronally gedurende de levensduur van de nematode9. Door live C. elegans te onderwerpen aan een kort en gefocust lichtpunt, wordt een enkel neuron gefotoswitcheerd en wordt de omgebouwde HTT-D2 in de loop van de tijd bijgehouden. Om de hoeveelheid HTT-D2 te laten afnemen, wordt het verschil tussen het rode signaal van de vers omgebouwde HTT-D2 vergeleken met het resterende rode signaal van HTT-D2 na een bepaalde periode. Daarom wordt het mogelijk om te onderzoeken hoe huntingtine wordt afgebroken wanneer het in zijn uitgebreide en toxische vorm wordt gevonden in vergelijking met zijn fysiologische vorm; hoe anterie of achterste neuronen anders reageren op de aanwezigheid van Q97 versus Q25, vooral over langere perioden; en hoe de ineenstorting van het proteostasenetwerk (PN) tijdens de vergrijzing bijdraagt aan de verschillen in degradatiepercentages. Deze resultaten beschrijven slechts een kleine reeks opmerkingen over de omzet van HTT-D2. Echter, veel meer biologische vragen die relevant zijn voor zowel het gebied van eiwit aggregatie en proteostase kan worden aangepakt met deze in vivo toepassing.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om de functie van een eiwit te begrijpen is het belangrijk om de synthese, locatie en afbraak ervan te begrijpen. Met de ontwikkeling van nieuwe, stabiele en heldere FPs is het visualiseren en monitoren van POI’s eenvoudiger en efficiënter geworden. Genetisch uitgedrukte fusieps zoals Dendra2 zijn uniek gepositioneerd om de stabiliteit van een POI te bestuderen. Bij blootstelling aan paars-blauw licht breekt Dendra2 op een precieze locatie binnen een triade van geconserveerde aminozuren. De fluorofophore ondergaat een k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen de DFG (KI-1988/5-1 aan JK, NeuroCure PhD fellowship door de NeuroCure Cluster of Excellence aan MLP) voor financiering. We erkennen ook de Imaging Core Facility van het Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology Berlin (FMP) voor het leveren van de imaging opgezet. Daarnaast willen we Diogo Feleciano bedanken die het Dendra2-systeem in het lab heeft opgezet en instructies heeft gegeven.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
References
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).
- Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).
- Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).
- . Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition (2020)
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).
- Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
- Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , 1-19 (2005).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).
- Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).
- Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).
- Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).
- Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).
