في فيفو الكم من دوران البروتين في الشيخوخة C. Elegans باستخدام Dendra2 قابلة للفوتونات
Summary
هنا هو بروتوكول لرصد تدهور البروتين huntingtin تنصهر على الفلوروفور Dendra2 القابلة للفوتونات.
Abstract
يتم تصنيع البروتينات وتحللها باستمرار داخل الخلية للحفاظ على التوازن. القدرة على رصد تدهور البروتين من الفائدة هو المفتاح لفهم دورة حياتها، ولكن أيضا للكشف عن الاختلالات في شبكة بروتيوستاسيس. هذه الطريقة تبين كيفية تتبع تدهور البروتين المسبب للمرض huntingtin. يتم التعبير عن نسختين من huntingtin تنصهر إلى Dendra2 في الجهاز العصبي C. elegans: نسخة فسيولوجية أو واحدة مع امتداد موسع وممرض من الجلوتامين. Dendra2 هو بروتين فلوري قابل للفوتونات؛ بناء على الأشعة فوق البنفسجية قصيرة (UV) نبض الإشعاع، Dendra2 تبديل أطيافها الإثارة / الانبعاث من الأخضر إلى الأحمر. على غرار تجربة مطاردة النبض، يمكن رصد دوران Dendra2 الحمراء المحولة وتحديدها كميا، بغض النظر عن التداخل من الناحية الحديثة التي تم تصنيعها من نوع Green-Dendra2. باستخدام المجهر القائم على confocal ونظرا للشفافية البصرية من C. elegans، فمن الممكن لرصد وقياس تدهور هنتتين ديندرا2 في كائن حي ، والشيخوخة. يتم تدهور جزئيا هنتبينين العصبي-Dendra2 بعد فترة وجيزة من التحويل وتطهيرها أكثر مع مرور الوقت. النظم التي تتحكم في التدهور هي نقص في وجود هنتتينين متحولة والمزيد من ضعف مع الشيخوخة. الأنواع الفرعية العصبية داخل الجهاز العصبي نفسه يحمل قدرات دوران مختلفة ل huntingtin-Dendra2. عموما، رصد أي بروتين الفائدة تنصهر إلى Dendra2 يمكن أن توفر معلومات هامة ليس فقط على تدهورها واللاعبين من شبكة proteostasis المعنية، ولكن أيضا على موقعها، والاتجار بها، والنقل.
Introduction
البروتيوم للكائن الحي هو تجديد نفسها باستمرار. البروتينات هي المتدهورة باستمرار وتوليف وفقا للطلب الفسيولوجي للخلية. يتم القضاء على بعض البروتينات بسرعة، في حين أن البعض الآخر أطول عمرا. إن مراقبة ديناميكيات البروتين هي مهمة أبسط وأكثر دقة وأقل توغلاً عند استخدام البروتينات الفلورية المشفرة وراثياً. FPs شكل autocatalytically ويمكن أن تنصهر على أي بروتين من الفائدة (POI)، ولكن لا تتطلب الإنزيمات لطي أو الحاجة إلى العوامل المساعدة حفظ للأكسجين1. وقد تم مؤخرا تصميم جيل أحدث من FPs للتبديل لون عند التشعيع مع نبضة ضوء من الطول الموجي المحدد. هذه FPs القابلة للتكف عن (PAFPs) تسمح لوضع العلامات وتتبع POIs، أو العضيات أو الخلايا التي يقيمون فيها، ودراسة المعلمات الكمية و/ أو النوعية الخاصة بهم2. تتيح أجهزة FPs إمكانية تتبع حركة أي POI ، واتجاهها ، ومعدل الحركة ، ومعامل الانتشار ، والمتنقلة مقابل الكسور غير المتحركة ، والوقت الذي تتواجد فيه في مقصورة خلوية واحدة ، وكذلك معدل دورانها. بالنسبة لعضيات محددة ، يمكن تحديد الحركة والنقل ، أو الانشطار وأحداث الانصهار. بالنسبة لنوع خلية معين، يمكن تأسيس موضع الخلية ومعدل الانقسام والحجم والشكل. والأهم من ذلك أن استخدام PAFPs يسمح بالتتبع دون تصور مستمر ودون تدخل من أي مسبار مُنَسَك حديثاً. وقد استخدمت الدراسات في كل من الخلايا والكائنات الحية بأكملها بنجاح PAFPs لمعالجة المسائل البيولوجية في الجسم الحي، مثل تطور السرطان والنقائل، والتجمع أو تفكيك الهيكل الخلوي، والتفاعلات الحمض النووي الريبي/البروتين3. في هذه المخطوطة، يتم استخدام المجهر الخفيف وPAFPs للكشف عن معدلات دوران البروتينات المعرضة للتجميع huntingtin (HTT) في الجسم الحي في نموذج C. elegans من الأمراض العصبية.
البروتوكول الموصوف هنا يحدد كميّاً استقرار وتدهور البروتين الإنصهار huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 هو الجيل الثاني من أحادية الحروف PAFP4 أن تبديل لا رجعة فيه الانبعاثات / الإثارة أطياف من الأخضر إلى الأحمر استجابة للأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق المرئي، مع زيادة في شدتها تصل إلى 4،000 أضعاف5،6. Huntingtin هو البروتين المسؤول عن التسبب في مرض هنتنغتون (HD) ، وهو اضطراب وراثي وراثي قاتل. Huntingtin exon-1 يحتوي على امتداد الجلوتامين (CAG، Q). عندما يتم التعبير عن البروتين مع أكثر من 39Q، فإنه يخطئ في البروتين متحولة، سامة، و المسببة للأمراض. HTT متحولة عرضة للتجميع ويؤدي إلى موت الخلايا العصبية والانحطاط، إما كالأنواع القلوية القصيرة أو أكبر اميلويدات منظم للغاية7.
الخيطية هو نظام نموذجي لدراسة الشيخوخة والتنكس العصبي بفضل سهولة التلاعب بها ، وطبيعة الأيزوجيني ، وعمرها القصير ، وشفافيتها البصرية8. لدراسة استقرار HTT في الجسم الحي، وأعرب عن بناء الانصهار في الجهاز العصبي من C. elegans. A HTT-D2 transgene التي تحتوي إما على امتداد الفسيولوجية من 25Qs (HTTQ25-D2) أو امتداد المرضية من 97Qs (HTTQ97-D2) هو overexed عموم العصبية في جميع أنحاء حياة الخيطية9. من خلال إخضاع العيش C. elegans إلى نقطة وجيزة ومركزة من الضوء، يتم photoswitched خلية عصبية واحدة ويتم تعقب HTT-D2 تحويلها مع مرور الوقت. لتحديد كمية HTT-D2 المتدهورة، يتم مقارنة الفرق بين الإشارة الحمراء من HTT-D2 المحولة حديثا إلى الإشارة الحمراء المتبقية من HTT-D2 بعد فترة زمنية محددة. ولذلك ، يصبح من الممكن التحقيق في كيفية تدهور huntingtin عندما وجدت في شكلها الموسع والسامة مقارنة بشكلها الفسيولوجية ؛ كيف تستجيب الخلايا العصبية الأمامية أو الخلفية بشكل مختلف لوجود Q97 مقابل Q25 ، خاصة خلال فترات زمنية طويلة ؛ وكيف أن انهيار شبكة البروتيوستاسيس (PN) أثناء الشيخوخة يساهم في الاختلافات في معدلات التدهور. هذه النتائج تصف فقط مجموعة صغيرة من الملاحظات على دوران HTT-D2. ومع ذلك، يمكن معالجة العديد من المسائل البيولوجية المتعلقة بكل من مجال تجميع البروتينات وبروتيوستاسيس بهذا في تطبيق vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
لفهم وظيفة البروتين من المهم أن نفهم تركيبها، والموقع، والتدهور. مع تطور الرواية ، ومستقرة ، ومشرقة FPs ، تصور ورصد الملوثات العضوية الثابتة أصبحت أسهل وأكثر كفاءة. PAFPs الانصهار أعرب عنها وراثيا مثل Dendra2 هي في وضع فريد لدراسة استقرار POI. عند التعرض للضوء الأرجواني والأزرق، فواصل Dendra2 في مكان ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف DFG (KI-1988/5-1 إلى JK, NeuroCure دكتوراه الزمالة من قبل مجموعة NeuroCure التميز إلى MLP) للتمويل. كما أننا نعترف بمرفق التصوير الأساسي التابع لمعهد أبحاث لايبنتز لعلم الأدوية الجزيئية في برلين (FMP) لتوفيره التصوير. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر ديوغو فيليسيانو الذي أنشأ نظام Dendra2 في المختبر وقدم التعليمات.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
References
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).
- Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).
- Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).
- . Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition (2020)
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).
- Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
- Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , 1-19 (2005).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).
- Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).
- Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).
- Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).
- Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).
