Fotodönüştürülebilir Dendra2 kullanarak Yaşlanma C. Elegans Protein Ciro Vivo Quantification
Summary
Burada fotoconvertible florofor Dendra2 erimiş protein huntingtin bozulmasını izlemek için bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Proteinler homeostazkorumak için bir hücre içinde sürekli olarak sentezlenir ve bozulur. İlgi çekici bir proteinin bozulmasını izleyebilmek sadece yaşam döngüsünü değil, aynı zamanda proteostaz ağındaki dengesizlikleri ortaya çıkarmak için de önemlidir. Bu yöntem, hastalığa neden olan protein huntingtin bozulmasıizlemek için nasıl gösterir. Dendra2’ye erimiş huntingtin’in iki versiyonu C. elegans sinir sisteminde ifade edilir: fizyolojik bir versiyonu veya glutaminlerin genişletilmiş ve patojenik uzantısı olan bir versiyonu. Dendra2 fotoconvertible floresan proteindir; kısa bir ultraviyole (UV) ışınlama darbesi üzerine, Dendra2 uyarma / emisyon spektrumları yeşilden kırmızıya değiştirir. Bir darbe-kovalamaca deneybenzer, dönüştürülmüş kırmızı-Dendra2 cirosu izlenebilir ve ölçülebilir, ne olursa olsun yeni sentezlenen yeşil-Dendra2 gelen girişim. Konfokal tabanlı mikroskopi ve C. elegansoptik şeffaflık nedeniyle kullanarak, bir canlı, yaşlanan organizmada huntingtin-Dendra2 bozulmasını izlemek ve ölçmek mümkündür. Nöronal huntingtin-Dendra2 dönüşümden kısa bir süre sonra kısmen bozulur ve zamanla daha da temizlenir. Bozulmayı kontrol eden sistemler mutant huntingtin varlığında eksiktir ve yaşlanma ile daha da bozulur. Aynı sinir sistemi içinde nöronal alt tiphuntingtin-Dendra2 için farklı ciro kapasiteleri sergiler. Genel olarak, Dendra2’ye kaynaşmış herhangi bir ilgi proteininin izlenmesi, sadece bozulması ve ilgili proteostasis ağının oyuncuları hakkında değil, aynı zamanda konumu, ticareti ve ulaşımı hakkında da önemli bilgiler sağlayabilir.
Introduction
Yaşayan bir organizmanın proteomu sürekli kendini yeniliyor. Proteinler bir hücrenin fizyolojik talebine göre sürekli olarak bozulur ve sentezlenir. Bazı proteinler hızla ortadan kaldırılırken, diğerleri daha uzun ömürlüdür. Genetik olarak kodlanmış floresan proteinler (LP)’ler kullanılırken protein dinamiklerinin izlenmesi daha basit, daha doğru ve daha az invaziv bir görevdir. FP’ler otokatalitik olarak oluşur ve herhangi bir ilgi proteinine (POI) kaynaşabilir, ancak enzimlerin katlanabilir veya oksijen1için tasarruf kofaktöre ihtiyaç duymasını gerektirmez. Yeni nesil LP’ler, belirlenen dalga boyundaki bir ışık darbesi ile ışınlama üzerine renk değiştirmek üzere tasarlandı. Bu fotoaktibl FP’ler (PAPC’ler) İçN’lerin veya içinde oturdukları organellerin veya hücrelerin etiketlemesine ve izlenmesine ve nicel ve/veya nitel parametrelerini incelemelerine olanak sağlar2. FP’ler, herhangi bir POI’nin hareketini, yönünü, hareket oranını, difüzyon katsayısını, mobil ve hareketsiz fraksiyonları, tek bir hücresel bölmede bulunduğu zamanı ve ciro oranını izlemeyi mümkün kılar. Belirli organeller için, hareket ve taşıma, ya da fizyon ve füzyon olayları belirlenebilir. Belirli bir hücre türü için, bir hücrenin konumu, bölme hızı, hacim ve şekil belirlenebilir. En önemlisi, PAAP’lerin kullanımı sürekli görselleştirme olmadan ve yeni sentezlenmiş herhangi bir sondanın müdahalesi olmadan izleme sağlar. Hem hücrelerde hem de bütün organizmalarda yapılan çalışmalar, kanser ve metastaz, sitoiskeletin montajı veya ayrışması ve RNA-DNA/protein etkileşimleri gibi biyolojik soruları vivo olarak ele almak için PADP’leri başarıyla istihdam etti3. Bu yazıda, ışık mikroskobu ve PAPC’ler nörodejeneratif hastalığın C. elegans modelinde in vivo in agregasyona eğilimli protein huntingtinin (HTT) ciro oranlarını ortaya çıkarmak için kullanılır.
Burada açıklanan protokol, huntingtin-Dendra2 (HTT-D2) füzyon proteininin stabilitesini ve bozulmasını ölçer. Dendra2 ikinci nesil monomerik PAFP4 geri dönülmez ya UV veya görünür mavi ışık yanıt olarak yeşil den kırmızı emisyon / uyarma spektrumları anahtarları, kadar yoğunluğunda bir artış ile 4,000 kat5,6. Huntingtin Huntington hastalığı (HD), ölümcül bir kalıtsal nörodejeneratif bozukluk neden sorumlu proteindir. Huntingtin exon-1 glutaminler (CAG, Q) bir streç içerir. Protein 39Q üzerinde ifade edildiğinde, bir mutant içine yanlış, toksik, ve patojenik protein. Mutant HTT toplama yatkındır ve nöronal hücre ölümü ve dejenerasyona yol açar, ya kısa oligomerik türler olarak ya da daha büyük yüksek yapılandırılmış amiloidler7.
Nematod manipülasyon kolaylığı sayesinde yaşlanma ve nörodejenerasyon eğitimi için bir model sistemidir, izojenik doğa, kısa ömrü, ve optik şeffaflık8. In vivo HTT stabilitesini incelemek için, bir füzyon yapısı C. eleganssinir sisteminde ifade edildi. 25Qs (HTTQ25-D2) fizyolojik bir streç veya 97Qs (HTTQ97-D2) patolojik bir streç içeren bir HTT-D2 transgene nematod ömrü boyunca pan-nöronsal aşırı ifade edilir9. Canlı C. eleganları kısa ve odaklanmış bir ışık noktasına tabi tutarak, tek bir nöron fotoşunla çevrilir ve dönüştürülmüş HTT-D2 zaman içinde izlenir. Bozulmuş HTT-D2 miktarını belirlemek için, yeni dönüştürülmüş HTT-D2’nin kırmızı sinyali arasındaki fark, belirlenen bir süre sonra HTT-D2’nin kalan kırmızı sinyaliile karşılaştırılır. Bu nedenle, huntingtin fizyolojik formuna göre genişletilmiş ve toksik formunda bulunduğunda nasıl bozulduğunu araştırmak mümkün olur; anterior veya posterior nöronlar Q97 karşı Q25 varlığına farklı tepki nasıl, özellikle uzun sürelerde; ve yaşlanma sırasında proteostasis ağının (PN) çöküşünün bozulma oranlarındaki farklılıklara nasıl katkıda olduğu. Bu sonuçlar sadece HTT-D2’nin cirosu üzerine küçük bir gözlem kümesini açıklar. Ancak, protein toplama ve proteostaz alanı ile ilgili daha birçok biyolojik sorular bu in vivo uygulama ile ele alınabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir proteinin işlevini anlamak için sentezini, yerini ve bozulmasını anlamak önemlidir. Yeni, kararlı ve parlak LP’lerin geliştirilmesiyle, İçN’lerin görselleştirilmesi ve izlenmesi daha kolay ve verimli hale gelmiştir. Dendra2 gibi genetik olarak ifade edilen füzyon PAFP’leri bir İçN’nin stabilitesini incelemek için benzersiz bir konuma sahiptir. Mor-mavi ışığa maruz kaldıktan sonra, Dendra2 korunmuş amino asitlerin bir üçlü içinde kesin bir yerde tatili. Florofor küçük bir yapısal değişi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz DFG (KI-1988/5-1 JK, NeuroCure Doktora Bursu MLP mükemmellik NeuroCure Küme tarafından) finansman için kabul ediyoruz. Ayrıca Leibniz Moleküler Farmakoloji Enstitüsü Berlin Görüntüleme Çekirdek Tesisi (FMP) görüntüleme kurmak sağlamak için kabul ediyoruz. Buna ek olarak, laboratuvarda Dendra2 sistemini kuran ve talimatlar veren Diogo Feleciano’ya teşekkür ederiz.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
References
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).
- Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).
- Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).
- . Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition (2020)
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).
- Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
- Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , 1-19 (2005).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).
- Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).
- Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).
- Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).
- Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).
