ב Vivo פיקציה של מחזור החלבון בהזדקנות C. אלגיה באמצעות Photoconvertible המרה Dendra2
Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול כדי לפקח על השפלה של החלבון huntingtin התמזגו הפוטוורידים פלואורואופפור Dendra2.
Abstract
חלבונים מסונתז ומושפל באופן קבוע בתוך התא כדי לשמור על הומאוסטזיס. היכולת לפקח על השפלה של חלבון של עניין היא המפתח להבנת לא רק מחזור החיים שלה, אלא גם לחשוף חוסר איזון ברשת פרוטאוסטזיס. שיטה זו מראה כיצד לעקוב אחר ההשפלה של מחלת החלבון הגורם למחלות. שתי גרסאות של huntingtin התמזגו ל Dendra2 מבוטא במערכת העצבים של C. אלגיה : גרסה פיזיולוגית או אחת עם מתיחה מורחבת ופתוגניים של glutamines. Dendra2 הוא חלבון פלורסנט פוטולהמרה; על פולס אולטרה סגול (UV) הקרנה, Dendra2 מעביר את הריגוש שלה/פליטה ספקטרום מירוק לאדום. בדומה לניסוי מרדף דופק, המחזור של red-Dendra2 המרה יכול להיות מנוטר וכימות, ללא קשר להפרעה מחדש מסונתז ירוק-Dendra2. בעזרת מיקרוסקופ מבוסס-מיקוד ובגלל השקיפות האופטית של ה -“אלאלגיה“, ניתן לנטר ולכמת את ההשפלה של הDendra2 באורגניזם חי ומזדקן. הDendra2 הנוירוונאליות מושפלת באופן חלקי מיד לאחר ההמרה ומנוקה לאורך זמן. מערכת השליטה בירידה בנוכחות מוטציות huntingtin והיא לקויה עוד יותר עם הזדקנות. תת העצבי בתוך מערכת העצבים אותה מוצג קיבולות מחזור שונות עבור huntingtin-Dendra2. בסך הכל, ניטור כל חלבון של עניין התמזגו Dendra2 יכול לספק מידע חשוב לא רק על השפלה שלה ואת השחקנים של הרשת פרוטאוסטזיס מעורב, אלא גם על מיקומו, סחר, ותחבורה.
Introduction
הפרוטאום של אורגניזם חי מתחדש באופן תמידי. חלבונים מושפל ברציפות ומסונתז בהתאם לדרישת הפיסיולוגית של תא. חלבונים מסוימים מסולקים במהירות, בעוד אחרים חיים יותר. ניטור הדינמיקה חלבון הוא משימה פשוטה יותר, מדויקת יותר, פחות פולשנית בעת שימוש בחלבונים פלואורסצנטי מקודד גנטית (FPs). FPs טופס אוטוזרז והוא יכול להיות מותך כל חלבון של עניין (פוי), אבל לא דורשים אנזימים לקפל או צריך קופנים לשמור עבור חמצן1. דור חדש של FPs ההונדס לאחרונה כדי לעבור צבע על הקרנה עם דופק קל של אורך גל נקבע. התמונות האלה FPs (פפס) לאפשר תיוג ומעקב של POIs, או ארגונית או התאים שהם מתגוררים, וכיצד לבחון את הפרמטרים כמותיים ו/או איכותניים שלהם2. FPs לאפשר מעקב אחר כל התנועה של פוי, כיוון, שיעור של תנועה, מקדם דיפוזיה, נייד לעומת שברים משותק, הזמן שהוא שוכן בתא הסלולר אחד, כמו גם קצב המחזור שלה. ניתן לקבוע את התנועה לארגון מסוים, לתחבורה, לאירועים ביקוע ולהיתוך. עבור סוג תא מסוים, ניתן ליצור מיקום תא, קצב החילוק, אמצעי האחסון והצורה. באופן מכריע, השימוש ב-פפס מאפשר מעקב ללא הדמיה רציפה וללא הפרעות מכל מכשיר שהוא לאחרונה. מחקרים הן בתאים והן באורגניזמים שלמים המועסקים בהצלחה פפס לטיפול שאלות ביולוגיות בvivo, כגון התפתחות של סרטן גרורות, הרכבה או פירוק של שלד התא, ו-RNA-DNA/חלבון אינטראקציות3. בכתב יד זה, מיקרוסקופ אור ו פפס משמשים כדי לחשוף את שיעורי המחזור של huntingtin חלבון הנוטה לצבור (HTT) בvivo במודל של C. אלגיה של מחלת ניווניות.
הפרוטוקול המתואר כאן ככמת את היציבות וההשפלה של חלבון ההיתוך huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 הוא הדור השני monomeric פמפ4 כי בוררים הפיך הפליטה שלה/עירור ספקטרום מירוק לאדום בתגובה או UV או אור כחול גלוי, עם גידול בעוצמתו של עד 4,000-קיפול5,6. Huntingtin הוא החלבון האחראי לגרימת מחלת הנטינגטון (HD), הפרעת ניווניות תורשתי קטלנית. הhuntingtin exon-1 מכיל קטע של glutamines (הקאג, Q). כאשר החלבון מתבטא עם מעל 39, הוא מתקפל לתוך חלבון מוטציה, רעיל ופתוגניים. מוטציה HTT הוא נוטה לצבור ומוביל מוות עצבי תאים וניוון, או מינים oligomeric קצרים או גדול מאוד בנוי amyloids7.
נמטודות היא מערכת מודל ללמוד הזדקנות ניוון נוירואני בזכות הקלות של מניפולציה, הטבע האיזוגני, תוחלת חיים קצרה, ושקיפות אופטית שלה8. כדי ללמוד את יציבותו של HTT בvivo, מבנה היתוך התבטא במערכת העצבים של הג. העברה של HTT-D2 המכיל מתיחה פיזיולוגית של 25Qs (HTTQ25-D2) או מתיחה פתולוגית של 97Qs (HTTQ97-D2) הוא הביע מוגזם פאן-neuronally בכל תקופת החיים של nematode9. על ידי העברת החיים C. אלגיה לנקודה קצרה וממוקדת של אור, תא העצב בודד הוא מיתוג והמרה htt-D2 מתבצע במשך הזמן. כדי לקבוע את כמות HTT-D2 המושפל, ההפרש בין האות האדום של HTT-D2 הטרי המומר מושווה לאות האדום הנותרים של HTT-D2 לאחר פרק זמן קבוע. לפיכך, ניתן לחקור את האופן שבו הונטינטין מושפל כאשר הוא נמצא בצורתו המורחבת והרעילה בהשוואה לצורתו הפיזיולוגית; כיצד הנוירונים הקדמי או האחורי להגיב באופן שונה לנוכחות של Q97 לעומת Q25, במיוחד על תקופות זמן ממושך; וכיצד התמוטטות הרשת פרוטאוסטזיס (PN) במהלך הזדקנות תורמים להבדלים בשיעורי השפלה. תוצאות אלה מתארות רק קבוצה קטנה של תצפיות על תחלופת HTT-D2. עם זאת, שאלות רבות יותר ביולוגיות הרלוונטיות הן לתחום של צבירת חלבון ו פרוטאוסטזיס יכול להיות ממוען עם זה ביישום vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי להבין את תפקודי החלבון חשוב להבין את הסינתזה, המיקום וההשפלה שלו. עם פיתוח של רומן, יציב, FPs בהיר, המחשה וניטור POIs הפך קל יותר ויעיל יותר. מבחינה גנטית הביע פפס היתוך כגון Dendra2 ממוקמים באופן ייחודי כדי ללמוד את יציבותו של פוי. עם החשיפה לאור סגול-כחול, Dendra2 מתפרק במיקום מדויק בתוך משולש של ח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים את DFG (KI-1988/5-1 לייק, מלגת נוירוקיור PhD על ידי מקבץ המצוינות של נוירוקיור כדי MLP) למימון. אנו מכירים גם את מתקן ליבת ההדמיה של המכון לחקר לייבניץ לפרמקולוגיה מולקולרית ברלין (FMP) לאספקת ההדמיה להגדיר. בנוסף, אנו רוצים להודות לדיוגו פללאנו שהקים את מערכת Dendra2 במעבדה וסיפק הוראות.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
References
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).
- Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).
- Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).
- . Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition (2020)
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).
- Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
- Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , 1-19 (2005).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).
- Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).
- Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).
- Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).
- Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).
