फोटोवर्टिबल Dendra2 का उपयोग कर एजिंग सी Elegans में प्रोटीन कारोबार के वीवो क्वांटिफिकेशन में
Summary
यहां प्रस्तुत प्रोटीन हंटिंगटिन के क्षरण की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल है जो फोटोकंवर्टिबल फ्लोरोफोर Dendra2 को फ्यूज किया गया है।
Abstract
प्रोटीन को होमोस्टेसिस बनाए रखने के लिए एक कोशिका के भीतर लगातार संश्लेषित और अपमानित किया जाता है। ब्याज की एक प्रोटीन के क्षरण की निगरानी करने में सक्षम होने के नाते न केवल अपने जीवन चक्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क में असंतुलन को उजागर करने के लिए । इस विधि से पता चलता है कि रोग पैदा करने वाले प्रोटीन हंटिंगटिन के क्षरण को कैसे ट्रैक किया जाए। Dendra2 से जुड़े हंटिंगटिन के दो संस्करण सी एलिगेंस तंत्रिका तंत्र में व्यक्त किए जाते हैं: एक शारीरिक संस्करण या ग्लूटामाइंस के विस्तारित और रोगजनक खिंचाव के साथ एक। Dendra2 एक फोटोवर्टिबल फ्लोरोसेंट प्रोटीन है; एक छोटे पराबैंगनी (यूवी) विकिरण नाड़ी पर, Dendra2 हरे रंग से लाल करने के लिए अपने उत्तेजन/उत्सर्जन स्पेक्ट्रा स्विच । नाड़ी-चेस प्रयोग के समान, परिवर्तित लाल-Dendra2 के कारोबार की निगरानी और मात्रा निर्धारित की जा सकती है, चाहे नए संश्लेषित हरे-Dendra2 से हस्तक्षेप कुछ भी हो। कॉन्फोकल-आधारित माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना और सी एलिगेंसकी ऑप्टिकल पारदर्शिता के कारण, जीवित, उम्र बढ़ने वाले जीव में हंटिंगटिन-Dendra2 के क्षरण की निगरानी और मात्रा निर्धारित करना संभव है। न्यूरोनल हंटिंगटिन-Dendra2 को रूपांतरण के तुरंत बाद आंशिक रूप से अपमानित किया जाता है और समय के साथ आगे मंजूरी दे दी जाती है। गिरावट को नियंत्रित करने वाली प्रणालियों में उत्परिवर्ती हंटिंगटिन की उपस्थिति में कमी होती है और उम्र बढ़ने के साथ और बिगड़ा होता है। एक ही तंत्रिका तंत्र के भीतर न्यूरोनल उपप्रकार हंटिंगटिन-Dendra2 के लिए विभिन्न कारोबार क्षमताओं का प्रदर्शन करते हैं। कुल मिलाकर, Dendra2 के लिए जुड़े ब्याज के किसी भी प्रोटीन की निगरानी न केवल इसके क्षरण और इसमें शामिल प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क के खिलाड़ियों पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं, लेकिन यह भी अपने स्थान, तस्करी, और परिवहन पर ।
Introduction
जीव-जीव का प्रोटेम लगातार खुद का नवीनीकरण कर रहा है। प्रोटीन को कोशिका की शारीरिक मांग के अनुसार लगातार अपमानित और संश्लेषित किया जाता है। कुछ प्रोटीन जल्दी खत्म हो जाते हैं, जबकि अन्य लंबे समय तक रहते हैं। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपीएस) का उपयोग करते समय प्रोटीन गतिशीलता की निगरानी करना एक सरल, अधिक सटीक और कम आक्रामक कार्य है। एफपीएस ऑटोटैक्टिटिक रूप से बनाते हैं और किसी भी प्रोटीन ऑफ इंटरेस्ट (पीओआई) में शामिल हो सकते हैं, लेकिन एंजाइमों को गुना करने की आवश्यकता नहीं है या ऑक्सीजन1के लिए कोफैक्टर बचाने की आवश्यकता नहीं है। एफपीएस की एक नई पीढ़ी को हाल ही में निर्धारित तरंगदैर्ध्य की हल्की नब्ज के साथ विकिरण पर रंग स्विच करने के लिए इंजीनियर किया गया है। ये फोटोएक्टिवेट एफपीएस (PAFPs) पीओआई, या ऑर्गेनेल्स या कोशिकाओं की लेबलिंग और ट्रैकिंग के लिए अनुमति देते हैं, और उनके मात्रात्मक और/या गुणात्मक मापदंडों की जांच करने के लिए2। एफपीएस किसी भी पीओआई के आंदोलन, दिशात्मकता, लोकोमोशन की दर, प्रसार के गुणांक, मोबाइल बनाम स्थिर अंशों को ट्रैक करना संभव बनाते हैं, यह समय एक सेलुलर डिब्बे में रहता है, साथ ही साथ इसकी कारोबार दर भी। विशिष्ट ऑर्गेनेल्स के लिए, लोकोमोशन और परिवहन, या विखंडन और संलयन घटनाओं का निर्धारण किया जा सकता है। एक विशेष सेल प्रकार के लिए, एक सेल की स्थिति, विभाजन की दर, मात्रा, और आकार स्थापित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, PAFPs का उपयोग निरंतर दृश्य के बिना और किसी भी नए सिंथेटीकृत जांच से हस्तक्षेप के बिना ट्रैकिंग की अनुमति देता है। कोशिकाओं और पूरे जीवों दोनों में अध्ययन सफलतापूर्वक PAFPs को नियोजित किया है, जैसे कैंसर और मेटास्टेसिस के विकास, विधानसभा या साइटोस्केलेटन के disassembly, और आरएनए-डीएनए/प्रोटीन इंटरैक्शन3। इस पांडुलिपि में, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग के सी एलिगेंस मॉडल में वीवो में एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन हंटिंगटिन (एचटीटी) की कारोबार दरों को उजागर करने के लिए हल्के माइक्रोस्कोपी और पीएएफपी का उपयोग किया जाता है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल फ्यूजन प्रोटीन हंटिंगटिन-Dendra2 (HTT-D2) की स्थिरता और गिरावट की मात्रा। Dendra2 एक दूसरी पीढ़ी के मोनोमेरिक PAFP4 है कि अपरिवर्तनीय या तो यूवी या दिखाई नीली रोशनी के जवाब में हरे रंग से लाल करने के लिए अपने उत्सर्जन/उत्तेजन स्पेक्ट्रा स्विच, ४,०००-गुना5, 6,6तक की तीव्रता में वृद्धि के साथ । हंटिंगटिन हंटिंगटन रोग (एचडी) के कारण, एक घातक वंशानुगत न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार के कारण जिम्मेदार प्रोटीन है। हंटिंगटिन एक्सान-1 में ग्लूटामाइंस (सीएजी, क्यू) का खिंचाव होता है। जब प्रोटीन 39Q से अधिक के साथ व्यक्त किया जाता है, यह एक उत्परिवर्ती, विषाक्त, और रोगजनक प्रोटीन में गलत गुना । उत्परिवर्ती एचटीटी एकत्रीकरण से ग्रस्त है और न्यूरोनल सेल मृत्यु और पतन की ओर जाता है, या तो छोटी अल्पाहारिक प्रजातियों के रूप में या बड़े अत्यधिक संरचित एमिलॉयड7के रूप में।
नेमाटोड उम्र बढ़ने और न्यूरोडिजेनरेशन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली है, जो इसकी हेरफेर की आसानी, आइसोजेनिक प्रकृति, छोटी उम्र और इसकी ऑप्टिकल पारदर्शिता8के लिए धन्यवाद है। वीवो में एचटीटी की स्थिरता का अध्ययन करने के लिए, सी एलिगेंसके तंत्रिका तंत्र में एक संलयन निर्माण व्यक्त किया गया था। एक एचटीटी-डी 2 ट्रांसजीन जिसमें या तो 25Qs (HTTQ25-D2) का शारीरिक खिंचाव या 97Qs (HTTQ97-D2) का एक रोग खंड है, जो नेमाटोड के जीवनकाल9में पैन-न्यूरोनैली से अधिक है। लाइव सी एलिगेंस को प्रकाश के एक संक्षिप्त और केंद्रित बिंदु पर अधीन करके, एक न्यूरॉन फोटोस्विच किया जाता है और परिवर्तित एचटीटी-डी 2 को समय के साथ ट्रैक किया जाता है। एचटीटी-डी2 अवक्रमित की मात्रा स्थापित करने के लिए, हौसले से परिवर्तित एचटीटी-डी2 के रेड सिग्नल के बीच अंतर की तुलना निर्धारित अवधि के बाद एचटीटी-डी2 के शेष रेड सिग्नल से की जाती है । इसलिए, यह जांच करना संभव हो जाता है कि इसके शारीरिक रूप की तुलना में इसके विस्तारित और जहरीले रूप में पाए जाने पर हंटिंगटिन को कैसे अपमानित किया जाता है; कैसे पूर्वकाल या पीछे न्यूरॉन्स Q97 बनाम Q25 की उपस्थिति के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया, विशेष रूप से लंबे समय तक अवधि में; और कैसे उम्र बढ़ने के दौरान प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क (पीएन) के पतन क्षरण दरों में अंतर करने के लिए योगदान करते हैं । ये परिणाम केवल एचटीटी-डी2 के कारोबार पर टिप्पणियों के एक छोटे सेट का वर्णन करते हैं। हालांकि, प्रोटीन एकत्रीकरण और प्रोटेओस्टेसिस दोनों के क्षेत्र से संबंधित कई और जैविक प्रश्नों को वीवो एप्लिकेशन में इसके साथ संबोधित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटीन के कार्य को समझने के लिए इसके संश्लेषण, स्थान और गिरावट को समझना महत्वपूर्ण है। उपन्यास, स्थिर और उज्ज्वल एफपीएस के विकास के साथ, पीओआई की कल्पना और निगरानी करना आसान और अधिक कुशल हो गया है। आनु?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम वित्तपोषण के लिए एमएलपी को उत्कृष्टता के न्यूरोक्योर क्लस्टर द्वारा जेके, न्यूरोक्योर पीएचडी फैलोशिप को डीएफजी (KI-1988/5-1) स्वीकार करते हैं। हम इमेजिंग सेट अप प्रदान करने के लिए लीबनिज रिसर्च इंस्टीट्यूट फॉर मॉलिक्यूलर फार्माकोलॉजी बर्लिन (एफएमपी) की इमेजिंग कोर सुविधा को भी स्वीकार करते हैं। इसके अलावा, हम डायोगो फेलेसियानो का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं जिन्होंने लैब में Dendra2 सिस्टम की स्थापना की और निर्देश दिए ।
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
References
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).
- Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).
- Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).
- . Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition (2020)
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).
- Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
- Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , 1-19 (2005).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).
- Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).
- Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).
- Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).
- Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).
