In Vivo Kvantifiering av proteinomsättning i åldrande C. Elegans med photoconvertible Dendra2
Summary
Presenteras här är ett protokoll för att övervaka nedbrytningen av protein huntingtin smält till fotokonverterbara fluorofore Dendra2.
Abstract
Proteiner syntetiseras och bryts ned ständigt i en cell för att upprätthålla homeostas. Att kunna övervaka nedbrytningen av ett protein av intresse är nyckeln till att förstå inte bara dess livscykel, men också att upptäcka obalanser i proteostasnätverket. Denna metod visar hur man spårar nedbrytningen av det sjukdomsframkallande protein huntingtin. Två versioner av huntingtin smält till Dendra2 uttrycks i C. elegans nervsystemet: en fysiologisk version eller en med en utökad och patogen sträcka av glutaminer. Dendra2 är ett fotokonvertibelt fluorescerande protein; på en kort ultraviolett (UV) bestrålning puls, Dendra2 växlar sin excitation / utsläpp spektra från grönt till rött. I likhet med en puls-chase experiment, omsättningen av den konverterade röd-Dendra2 kan övervakas och kvantifieras, oavsett störningar från nyligen syntetiserade grön-Dendra2. Med hjälp av konfokalbaserad mikroskopi och på grund av den optiska transparensen i C. elegansär det möjligt att övervaka och kvantifiera nedbrytningen av huntingtin-Dendra2 i en levande, åldrande organism. Neuronal huntingtin-Dendra2 är delvis försämras strax efter omvandling och rensas ytterligare över tiden. De system som styr nedbrytningen är bristfälliga i närvaro av mutant huntingtin och är ytterligare nedsatt med åldrande. Neuronala subtyper inom samma nervsystem uppvisar olika omsättning kapacitet för huntingtin-Dendra2. Övergripande, övervakning av protein av intresse smält till Dendra2 kan ge viktig information inte bara om dess nedbrytning och aktörerna i proteostas nätverk inblandade, men också om dess läge, människohandel och transport.
Introduction
Proteomen av en bosatt organism förnyar sig ständigt. Proteiner bryts kontinuerligt ned och syntetiseras enligt en cells fysiologiska efterfrågan. Vissa proteiner elimineras snabbt, medan andra är längre levde. Övervakning av proteindynamiken är en enklare, mer exakt och mindre invasiv uppgift när du använder genetiskt kodade fluorescerande proteiner (FPs). FPs bildar autokatalytiskt och kan smälts till något protein av intresse (POI), men kräver inte enzymer att vika eller behöver kofaktorer spara för syre1. En nyare generation av FPs har nyligen konstruerats för att byta färg vid bestrålning med en ljuspuls av bestämd våglängd. Dessa fotoaktiva FPs (PAFPs) möjliggör märkning och spårning av långlivade organiska organisationer, eller organeller eller celler som de bor i, och att undersöka deras kvantitativa och/eller kvalitativa parametrar2. FPs gör det möjligt att spåra alla SEI: s rörelse, riktning, graden av förflyttning, koefficient för diffusion, mobil kontra orörlig fraktioner, den tid den finns i ett cellulärt fack, liksom dess omsättning. För specifika organeller kan förflyttning och transport, eller fission och fusion händelser bestämmas. För en viss celltyp kan en cells position, delningshastighet, volym och form fastställas. Avgörande, användningen av PAFPs tillåter spårning utan kontinuerlig visualisering och utan störningar från någon nyligen syntetiserade sond. Studier både i celler och i hela organismer har framgångsrikt använt PAFPs för att ta itu med biologiska frågor in vivo, såsom utveckling av cancer och metastasering, montering eller demontering av cytoskelettet, och RNA-DNA/protein interaktioner3. I detta manuskript används ljusmikroskopi och PAP:er för att avslöja omsättningshastigheten för aggregeringsbenägna protein huntingtin (HTT) in vivo i en C. elegans-modell av neurodegenerativa sjukdomar.
Protokollet beskrivs här kvantifierar stabilitet och nedbrytning av fusion protein huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 är en andra generationens monomeriska PAFP4 som oåterkalleligen växlar dess utsläpp / excitation spektra från grönt till rött som svar på antingen UV eller synligt blått ljus, med en ökning av dess intensitet på upp till 4.000-faldig5,6. Huntingtin är det protein som orsakar Huntingtons sjukdom (HS), en dödlig ärftlig neurodegenerativ sjukdom. Huntingtin exon-1 innehåller en sträcka av glutaminer (CAG, Q). När proteinet uttrycks med över 39Q, det misfolds i en mutant, giftiga och patogena protein. Mutant HTT är benägen att aggregering och leder till neuronal cell död och degeneration, antingen som korta oligomeric arter eller som större mycket strukturerade amyloids7.
Nematoden är ett modellsystem för att studera åldrande och neurodegeneration tack vare sin enkla manipulation, isogen natur, kort livslängd och dess optiska transparens8. För att studera stabiliteten hos HTT in vivo uttrycktes en fusionskonstruktion i nervsystemet hos C. elegans. En HTT-D2 transgen som innehåller antingen en fysiologisk sträcka på 25Qs (HTTQ25-D2) eller en patologisk sträcka på 97Qs (HTTQ97-D2) är överuttryckt pan-neuronally under hela nematodens livstid9. Genom att utsätta live C. elegans till en kort och fokuserad ljuspunkt, är en enda neuron fotostwitched och den konverterade HTT-D2 spåras med tiden. För att fastställa mängden HTT-D2 försämrad jämförs skillnaden mellan den röda signalen från den nyligen konverterade HTT-D2 med den återstående röda signalen från HTT-D2 efter en bestämd tidsperiod. Därför blir det möjligt att undersöka hur huntingtin bryts ned när den finns i dess utökade och giftiga form jämfört med dess fysiologiska form; hur främre eller bakre nervceller reagerar annorlunda på förekomsten av Q97 jämfört med Q25, särskilt under längre tidsperioder; och hur kollapsen av proteostasnätverket (PN) under åldrandet bidrar till skillnaderna i nedbrytningshastigheter. Dessa resultat beskriver endast en liten uppsättning observationer av HTT-D2:s omsättning. Många fler biologiska frågor som är relevanta för både området proteinaggregering och proteostas kan dock behandlas med denna in vivo-applikation.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att förstå ett proteins funktion är det viktigt att förstå dess syntes, plats och nedbrytning. Med utvecklingen av nya, stabila och ljusa FPs, visualisera och övervaka SEVÄRDHETER har blivit enklare och effektivare. Genetiskt uttryckt fusion PAFPs såsom Dendra2 är unikt placerade för att studera stabiliteten hos en sevärdhet. Vid exponering för lila-blått ljus, Dendra2 bryter på en exakt plats inom en triad av bevarade aminosyror. Fluorofore genomgår en liten strukturell förändring, vilket resultera…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi bekräftar DFG (KI-1988/5-1 till JK, NeuroCure PhD stipendium av NeuroCure Cluster of Excellence till MLP) för finansiering. Vi erkänner också Imaging Core Facility vid Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology Berlin (FMP) för att tillhandahålla bildbehandling inrättas. Dessutom vill vi tacka Diogo Feleciano som etablerade Dendra2-systemet i labbet och gav instruktioner.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
References
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).
- Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).
- Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).
- . Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition (2020)
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).
- Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
- Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , 1-19 (2005).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).
- Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).
- Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).
- Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).
- Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).
