Summary
Ett protokoll för att studera biologisk vävnad med hög rumslig upplösning med ultra-hög fält magnetisk resonansmikroskopi (MRM) med hjälp av mikrokyler presenteras. Steg-för-steg-instruktioner tillhandahålls för att karakterisera mikroskopilerna. Slutligen demonstreras optimering av avbildning på växtrötter.
Abstract
Detta protokoll beskriver en kalibrering för signal-till-brus -förhållande (SNR) och provberedningsmetod för solenoidala mikroskopiering kombinerat med biologiska prover, konstruerade för högupplöst magnetresonanstomografi (MRT), även kallad MR-mikroskopi (MRM). Det får användas vid prekliniska MR-spektrometrar, påvisas på Medicago truncatula rotprover . Mikroskopor ökar känsligheten genom att matcha storleken på RF-resonatorn med storleken på urvalet av intresse och möjliggör därmed högre bildupplösningar under en viss datainhämtningstid. På grund av den relativt enkla designen är solenoidal mikrokyler okomplicerade och billiga att konstruera och kan enkelt anpassas till provkraven. Systematiskt förklarar vi hur man kalibrerar nya eller hembyggda mikrokyler, med hjälp av en referenslösning. Kalibreringsstegen omfattar: pulseffektbestämning med hjälp av en nutationskurva; uppskattning av RF-fältets homogenitet. och beräkna ett volymnormaliserat signal-brusförhållande (SNR) med hjälp av standardpulssekvenser. Viktiga steg i provberedning för små biologiska prover diskuteras, samt möjliga förmildrande faktorer såsom magnetiska känslighetsskillnader. Tillämpningarna av en optimerad solenoidspole demonstreras genom högupplöst (13 x 13 x 13 μm3, 2,2 pL) 3D-avbildning av ett rotprov.
Introduction
Magnetisk resonanstomografi är ett mångsidigt verktyg för att noninvasively bild en mängd olika biologiska exemplar, allt från människortill enstakaceller 1,2,3. Medan MRI-skannrar för medicinska bildframställningsprogram vanligtvis använder magneter med en fältstyrka på 1,5 T till 3 T, avbildas encellsapplikationer vid mycket högre fältstyrka1,3,4. Studien av exemplar vid upplösningar under hundra mikrometer benämns magnetresonansmikroskopi (MRM)5. MRM lider dock av ett lågt signal-brusförhållande (SNR) jämfört med andra tillgängliga mikroskopi- eller avbildningstekniker (t.ex. optisk mikroskopi eller CT). Flera tillvägagångssätt kan eftersträvas för att optimera SNR6. Ett tillvägagångssätt är att använda en högre magnetfältstyrka, medan ett kompletterande tillvägagångssätt är att optimera signaldetektorn för enskilda prover. För den senare bör dimensionerna av detektorn justeras för att matcha måtten på provet av intresse. För små prover som är ≈0,5-2 mm i diameter (t.ex. rotvävnader) är mikroskopier användbart eftersom SNR är omvänt proportionell mot spoldiametern6,7. Upplösningar så höga som 7,8 x 7,8 x 15 μm3 har uppnåtts på djurceller med hjälp av dedikerade mikroskylder8. En mängd olika mikrospoletyper finns, med planar och solenoid spolar som oftast används beroende på ansökan och vävnad geometri9. Planar spolar har hög känslighet nära sin yta, vilket är användbart för applikationer på tunna skivor. Till exempel har en metod som utformats speciellt för avbildning perfused vävnad beskrivits för planar mikroskylor10. Dock har planar spolar en hög falloff av känslighet och ingen väldefinierad referenspulseffekt. Solenoid spolar, är cylindriska, har ett större område av ansökan och är mer gynnade för tjockare prover. Här beskriver vi egenskaperna hos solenoidspolen, ett protokoll för att förbereda prover för mikrospole MRI, samt kalibreringen av en solenoid mikrokyl (Figur 1A).
Solenoidspolen består av en ledande tråd som är ihopspolad, som en korkskruv, runt en kapillär som håller provet (Figur 1B). Mikrokolaggregat kan konstrueras med endast emaljerad koppartråd, ett sortiment av kondensatorer, och en lämplig bas för lödning av komponenterna (Figur 1B). De stora fördelarna är enkelheten och den låga kostnaden, kombinerat med goda prestandaegenskaper vad gäller SNR per enhetsvolym och B1-fälthomogenitet. Den enkla konstruktionen möjliggör snabb iteration av spole mönster och geometrier. De särskilda kraven på solenoid mikrokyldesign och sondkarakterisering (dvs., teorin om elektronik, mätningar arbetsbänk, och spektrometer mätningar för en mängd olika spole geometrier) har beskrivits utförligt på andraställen 7,11,12,13,14.
En solenoidspole kan byggas genom att man i åtanke har konstruktionsregler för de önskade dimensionerna enligt de riktlinjer som beskrivs påandra ställen 15,16. I detta specifika fall användes en spole med en innerdiameter på 1,5 mm, tillverkad av emaljerad koppartråd, 0,4 mm i diameter, loopade runt en kapillär på 1,5 mm yttre diameter. Denna solenoid hålls på en basplatta på vilken en krets görs, som består av en trimkondensator (2,5 pF), en variabel matchande kondensator (1,5-6 pF) samt koppar anslutningsledningar (Figur 1A, 1C). Trimkondensatorn väljs för att uppnå önskad resonansfrekvens på 950 MHz, medan den matchande kondensatorn väljs för att uppnå den maximala signalöverföringen vid en impedans på 50 Ohm. Den större kondensatorn är variabel för att möjliggöra finare justering. Vid regelbunden drift utförs trimning och matchning med hjälp av kondensatorer i probbasen. Den monterade mikrospolen behöver monteras på en sond så att den kan sättas in i magneten. Ytterligare en hållare kan krävas, beroende på systemet. Här använder vi en 22,3 T-magnetkombination med en Bruker Console Avance III HD i kombination med en Micro5-sond. I detta fall använde vi en modifierad stödinsats utrustad med nödvändiga anslutningar för att ansluta till sondens 1H-kanal (Bild 1A).
Spolens känslighetsmatchade utformning omfattar en reservoar med perfluorerad vätska för att minska känslighetsfel, som uppstår genom att kopparspolen ligger i närheten av provet17. En reservoar gjordes från en plastspruta för att innesluta spolen och fylld med fomblin. Eftersom den perfluorerade vätskan behöver omsluta spolen, reduceras den tillgängliga diametern för ett prov till en ytterdiameter på 1 mm. För att underlätta provbytet, preparerades provet i en kapillär med en ytterdiameter på 1 mm och en innerdiameter på 700 μm. Nödvändiga verktyg för provberedning visas i figur 2A.
Grundläggande experimentella MR-parametrar är mycket beroende av maskinvaran i det system som används, inklusive gradientsystem, fältstyrka och konsol. Flera parametrar kan användas för att beskriva systemets prestanda, av vilka 90° pulslängd och effekt, B1-homogenitet och SNR per enhetsvolym (SNR/mm3), är de mest praktiskt relevanta. SNR/mm3 är användbart för att jämföra prestanda för olika spolar på samma system18. Medan hårdvara skillnader mellan system kan finnas, en enhetlig tillämpning av ett benchmarking protokoll underlättar också jämförelsen av systemets prestanda.
Detta protokoll fokuserar på kalibrering och provberedning. Den stegvisa karakterisering av prestanda solenoid mikrokylor visas: kalibrera 90 ° pulslängd eller effekt; bedöma RF- fältet homogenitet; och beräkna SNR per volymenhet (SNR/mm3). En standardiserad spin-echo mätning med hjälp av en fantom beskrivs för att underlätta en jämförelse av spole mönster, som möjliggör optimering av distinkta applikationer. Fantom och biologiska provprovspreparat, specifika för mikrokolor, beskrivs. Protokollet får implementeras på vilken lämplig smalborst (≤60 mm) vertikal magnet som är utrustad med ett kommersiellt tillgängligt mikrobildsystem. För andra system kan den fungera som en riktlinje och kan användas med vissa justeringar.
Biologisk preparering av preparat för MR-mätningar är vanligtvis inte särskilt omfattande eftersom exemplaret avbildas så intakt som möjligt. Luftutrymmen i biologisk vävnad kan dock orsaka bildartefakter på grund av skillnader i magnetisk känslighet19. Effekten ökar med ökande magnetfältstyrka20. Således bör luftutrymmen undvikas vid höga fältst gioner, och detta kan kräva nedsänkning av provet i en vätska för att undvika luft runt vävnaden och avlägsnande av luftutrymmen inom vävnadsstrukturerna. Specifikt, när mikroskopiler är anställda, excision av önskad provvävnad kan krävas, följt av att dränka den i en lämplig vätska. Detta följs av insättning av provet i en förskuren kapillär, och slutligen tätning av kapillären med kapillärvax. Att använda vax som tätningsmedel istället för lim, flamtätning eller alternativ, innebär att provet lätt kan extraheras. Detta förfarande påvisas på roten av Medicago truncatula, en liten baljväxt. En fördel med detta protokoll är potentialen för efterföljande samregistrering av MR-data med optisk mikroskopi, eftersom provet inte förstörs under MR-mätningen.
Det presenterade protokollet är lämpligt för hög rumslig upplösning in situ mätningar, och mer genomarbetade mönster skulle kunna möjliggöra avbildning in vivo prover, där utmaningar relaterade till livsuppehållande system skulle behöva åtgärdas.
Protocol
OBS: Detta protokoll beskriver förfaranden för användning och utvärdering av spolegenskaper för en 1,5 mm innerdiameter (ID) solenoidspole (Figur 1). Spolen som används för att demonstrera protokollet är inrymt i en mottaglighet-matchade reservoar, men protokollet är lika tillämpligt på oöverträffade spolar. Protokollet kan vara anpassat till andra storlekar och olika spektrometeruppställningar.
1. Förberedelse för referensprov
- För att förbereda 100 mL av känslighetsreferenslösningen, lös 156,4 mg CuSO4 ∙ 5 H2O till 80 mL av D2O som finns i en 100 mL GL45-kolv. Kopparsulfatet minskar både T1 och T2 avkopplingstid, vilket möjliggör snabbare mätningar, medan D2O förhindrar strålningsdämpning och mättnadseffekter. Rör om manuellt tills fasta ämnen är helt upplösta.
- Justera volymen till 100 mL med hjälp av avjoniserat vatten för en slutkoncentration på 1 g/L CuSO4 (vattenfri, 6,3 mM). Denna koncentration är tillräcklig för att förkorta T1 och T2 avkoppling men inte för hög för att påverkas av nederbörd. Försegla referensprovet för att förhindra att förhållandet mellan H2O: D 2 Oändras.
- Eventuellt, anslut sonden till en nätverksanalysator, för att testa om spolen genljuder vid önskad resonansfrekvens. Utför ett S 11-refetanstest för att mäta det frekvensområde som uppnås genom trimning och för Q- faktormätningar enligt beskrivningen i detalj av Haase et al.14. Anslut mikrospolen till nätverksanalysatorn med hjälp av en co-axialkabel. Använd en BNC-adapterkabel vid behov.
- Ställ in centrumfrekvensen på nätverksanalysatorn på önskad resonansfrekvens, beroende på den avsedda magnetfältstyrkan för vilken spolen är utformad. Ställ därefter in svepbredden på 10 MHz. Justera den variabla kondensatorn på mikrospolsenheten, om den finns, till att finjustera reflektorsdippen till önskad frekvens.
- Registrera reftansnivån vid centrumfrekvensen och frekvensen f1 och f2 på nivån -7 dB. Använd dessa för att beräkna Q-faktorn på -7 dB-nivån enligt Haase et al.14
2. Provberedning
- Om du förbereder ett referensprov för spolkalibrering, överför 1 mL Av CuSO4 lösning till en urglasskål under ett stereomikroskop.
- Om du förbereder ett biologiskt prov, överför 1 mL perfluordekalin (PFD) till ett urglas under ett stereomikroskop, som kommer att användas för att dränka provet. PFD används eftersom det kan fylla luftutrymmen i preparatet, utan att komma in i biologiska celler. Det är inte heller observerbara av proton MRI. Täck omedelbart över urglaset med ett petriskålslock för att förhindra avdunstningsförlust, innan PFD behövs.
OBS: PFD är mycket flyktig och en potent långsiktig växthusgas21. När dess syrelösande egenskaper och dess låga viskositet inte krävs, kan det ersättas med Fomblin, en perfluoroether som också ger någon observerbar 1H signal, men som inte avdunstar så snabbt17. - Skär kapillärer av lämplig ytterdiameter till storlek, för att passa inuti mikrospolhållarens diameter (18 mm) och möjliggöra omplacering (Figur 1C). Använd en keramisk fräs för att göra ett snitt var 10-12 mm och bryta försiktigt på snittet punkt.
- Om du förbereder ett referensprov, använd pincett och stereomikroskop för att få en förskuren kapillär i kontakt med ytan av CuSO4-lösningen inuti urglaset, vilket gör att kapillärverkan kan fylla kapillären.
- Om du förbereder ett biologiskt prov, använd pincett och ett stereomikroskop, för att få en förskuren kapillär i kontakt med ytan av PFD inuti urglaset, vilket gör att kapillärverkan för att fylla kapillären fullt. Släpp kapillären i urglaset så att det blir helt nedsänkt.
- Extrahera försiktigt en fem veckor gammal hel rot system från dess tillväxt substrat, såsom en perlite mark ersättning. Rengör rotprovet minutiöst av rhizosheath. Avlägsna stora jordpartiklar med hjälp av pincett, och om mindre partiklar finns, ta bort dem genom att tvätta rotsystemet med destillerat vatten. Fotografera om det behövs för framtida referens. Välj och punktskatt en liten del av fibrösa roten fri från rhizosheath med hjälp av en skalpell.
- För vakuumbehandling, placera provet i ett 1,5 mL-rör som innehåller en lämplig fixativ lösning. Låt rörlocket vara av, och förslut sedan röret med parafilm för att täta rörets öppning. Sedan, stansa hål i filmen med ett vasst verktyg för att möjliggöra ventilation av röret.
- Placera provröret i en vakuumkammare, försegla kammaren, och anslut en lab membran vakuumpump till kammaren. Underställ provet att vakuumbehandling i upp till 30 minuter, för att minska förekomsten av luftfickor inom biologiska prover. Stoppa vakuumbehandlingen när inga luftbubblor ses fly provet.
- Medan du tittar genom ett stereomikroskop, använd pincett för att dränka provet i infiltrationsmediet som förberetts tidigare. Tvätta provet av potentiellt skräp.
- Sätt in provet i kapillären med hjälp av pincett, medan både kapillären och provet är helt nedsänkta för att undvika att luftbubblor inkluderas. Använd en mindre kapillär eller spruta nålspets som en skjutstång (Figur 2B).
- Ta provet kapillär från medium urglas, med hjälp av pincett. I fråga om PFD, täck över petriskålslocket.
- Forma silkespapperet till en fin punkt och använd det för att avlägsna cirka 1 mm vätska från kapillärens båda ändar.
- Smält en liten volym kapillärvax med hjälp av en vaxpenna. Applicera vax på båda sidor. Vaxet kommer att bli ogenomskinligt när det stelnar. Var noga med att utesluta luftbubblor från kapillären (Figur 2C).
OBS: Undvik överhettningsvax eller kapillär eftersom det kan orsaka explosiv koka av samt kavitationsfickor när det färdiga provet svalnar. - Efteråt, skrapa bort överflödigt vax från utsidan av kapillären med hjälp av en skalpell och torka rent med fint mjukpapper.
3. Montering av provet
- Placera en mikrospole under stereomikroskopet och sätt i provet med hjälp av pincett samtidigt som mikrospolen förvaras stadigt (Figur 2D).
- Använd en stång för att centrera provet i mikrospolen, genom att skjuta kapillären inuti solenoidspolen.
- Eventuellt, applicera självhäftande tejp för att fixera kapillärens läge.
- Inspektera kapillären för att säkerställa att inga luftbubblor är synliga inuti solenoidspolen, för att undvika MR-signalförstörelse orsakad av känslighetsskillnader.
- Fäst mikrospolen på sondbasens uttaget, samtidigt som mikrospolen förvaras upprätt (Bild 3A,3B).
- För försiktigt över lutningsspolarna med treaxlig axel över mikrospolen samtidigt som de matchar övertoningens vattenkylande kontakter mot den hos sondbasen (Figur 3C). Vrid skruvgängan på probbasen för att fixera övertoningen på plats.
OBS: Detta steg gäller endast för en Micro5-sond. När det gäller andra system som Micro2.5 eller Biospect, är gradienterna på ett separat uttag än spolen.
4. Fastställande av spolegenskaper
- Om spolen testas för första gången, använd referensprovlösningen för att skapa ett homogent prov, vilket är användbart vid effektkalibrering och B1-homogenitetstest. Potentiella känslighetsproblem på grund av spoltrådarna får testas enkelt med detta referensprov.
- Sätt in sonden i magneten och anslut nödvändiga kablar: RF-sändnings-/mottagskabel, vattenkylningsledningar, termoelementkabel och luftkylningsledning.
- Ställ in önskad vattenkylningstemperatur (rekommenderad 298 K) för vattenkylningsenheten.
- Ställ in måltemperaturen (298 K) och målgasflödet (300 L/h). Gasflödet kan vara annorlunda för en annan spole design eller prov volym. Detta gäller endast system med ett temperaturkontrollsystem.
OBS: Nästa steg är endast nödvändiga när du testar nya (hembyggda) spolar. - Anslut sonden med hjälp av en 50 Ω co-axialkabel till en nätverksanalysator med en lämpligt bred svepbredd (400 MHz), centrerad på den avsedda resonansfrekvensen.
- Observera resonantlägena genom att justera de variabla matchnings- och trimkondensatorer som finns i probbasen.
- Stäm och matcha resonantläget mot önskad frekvens.
- Eventuellt, bestämma spolkvalitetsfaktorn (Q-faktor) på nätverksanalysatorn. En metod för att erhålla kvalitetsfaktorn är att använda ett kopplingsnät och dividera centrumfrekvensen (fc) med bredden på reflektionsdippen vid -7 dB (dvs. Q = fc /(f1 - f2)14. Ställ in fc på magnetens driftfrekvens, medan f1 och f2 är inställda på -7 dB-punkten till vänster respektive höger om f c. Vissa nätverksanalysatorer har Q-faktorbestämning inbyggd.
- Initiera ett reflektanstest på skannern, vanligtvis kallat wobblekurva, och justera justeringen och matchningen vid behov. Det rekommenderas att ställa in någon tuning och matchande kondensatorer till mittpunkten av deras sortiment för nya spolar. Börja därför med en hög spektral svepbredd. I vissa fall kan det vara mer praktiskt att ställa in och matcha spolen utanför magneten på en nätverksanalysator.
- Välj en shim-fil för den största volymspolen för avbildningsproben om den är tillgänglig. Om start från en spole som har använts tidigare, använd en tillgänglig shim-fil. Om båda alternativen inte är tillgängliga börjar du med alla shimsvärden som är ställda till 0.
- Välj rätt spolekonfiguration för mikrospolen om den finns i bildhanteringsprogrammet (dvs., ParaVision). Skapa annars en ny spolekonfiguration som matchar spolens specifikationer (t.ex. enkelstämd eller dubbelstämd) enligt systemets manual. Uppskattningar för de säkra gränserna för denna solenoid mikrokokare som används i denna forskning med 1,5 mm innerdiameter i storlek är 1 ms vid 1 W toppeffekt och 1 mW kontinuerlig effekt.
VAR FÖRSIKTIG: De små kondensatorer (typiskt 1 mm i storlek) som behövs för mikroskopor är mycket känsliga och lätt skadade av höga spänningar. Automatiserad pulseffektbestämning kanske inte fungerar med icke-standardiserade spolar, och för höga krafter kan orsaka skador på spolen eller andra delar av spektrometern. Därför rekommenderas manuella justeringar. - Registrera en mutteriseringskurva för en ny spole för att få en indikation på korrekt RF-effekt för spolen (Figur 4). I fall de säkra gränserna för spolen är okända, börja med 10 μs vid en låg pulseffekt på 0,6 W och långsamt öka pulslängderna med 1 μs åt gången tills signalen visas.
- Med hjälp av ett FID-experiment i avsaknad av gradientkodning, variera RF-pulslängden systematiskt samtidigt som pulseffekten konstant. Den idealiska pulslängden är pulslängden, där signalintensiteten når maximalt. Om du testar en ny spole, använd en 10 μs puls med en mycket låg effekt först och börja öka pulseffekten gradvis.
OBS: I fall effekten är mycket högre än förväntat för kombinationen av spolegenskaper och spektrometer, är detta redan en indikation på att fel resonansläge har valts. - För en spole med ett homogent B1-fält, som en solenoidspole, bestäm 180° puls där signalintensiteten minskar tillnoll 22.
- Med hjälp av ett FID-experiment i avsaknad av gradientkodning, variera RF-pulslängden systematiskt samtidigt som pulseffekten konstant. Den idealiska pulslängden är pulslängden, där signalintensiteten når maximalt. Om du testar en ny spole, använd en 10 μs puls med en mycket låg effekt först och börja öka pulseffekten gradvis.
- Ställ in den bestämda 90° pulseffekten i justeringskortet för den skapade studien. I ParaVision får referenseffektjusteringskortet användas för att komma in i den hårda pulseffekten.
- Använd en localizer scan med 3 skivor, ett segment i var och en av de tre primära axlarna, för att lokalisera positionen för spolen inom magneten. Det gör du genom att läsa in en lokalisatorskanning från spektrometerns standardbibliotek. Från och med ett stort synfält utan förskjutning rekommenderas. Utför en automatiserad justering av mottagarens förstärkning och starta mätningen manuellt.
OBS: Om provet är exakt i mitten av gradientsystemet, kommer localizer scan visar provet. Om spolen eller provet inte är centrerad i bildsegmenten eller saknas behöver lokalisatorskanningen justeras, i vilket fall steg 4.12 behöver utföras igen. - Alternativt, använd ett kompletterande sätt att hitta rätt 90° puls baserat på bildutvärdering. När en ungefärlig pulseffekt hittats med hjälp av mutterkurvan, justera pulskrafterna gradvis för att kontrollera bilden för B1-fält homogenitet. För vissa spolar med ett inhomogent B1-fält kan den 90° pulseffekt som bestäms med hjälp av nötningskurvan överskattas, vilket leder till övertappning i den önskade sweet spot av spolen. I så fall minskar du referenspulseffekten och kontrollerar de nya bilderna mot de tidigare bilderna (Bild 5).
- Shimsa manuellt magnetfältet baserat på FID-signalen. En rekommenderad order för inledande shimming är Z-Z2-Z-X-Y-Z-Z2-Z-XY-XZ-YZ-Z. När det gäller en solenoid, huvud symmetri-axeln är i XY-planet. Därför kan shims i olika riktningar resultera i en starkare korrigering av B0 homogenitet för denna spole konfiguration. Högre ordning shims har liten effekt och kan ignoreras.
- Beräkna en volym-normaliserad SNR för att möjliggöra jämförelse av mikrospole egenskaper över olika system, anpassad från tillverkarens protokoll18. För de mikrospoler som används här, använde vi en spin-echo-sekvens med följande parametrar: field-of-view (FOV) 6 mm x 6 mm, repetitionstid (TR) 1000 ms, ekotid (TE) 7 ms, Matrix 256 x 256 och skivatjocklek = 0,5 mm. Justera segmenttjockleken tills mottagarens förstärkning är enhetlig. Därefter justerar du antalet segment så att segment sträcker sig utanför regionen B1-fält homogenitet. Spela in bilderna utan signal medelvärde, om möjligt.
- Bestäm volymen normaliserad SNR (SNR/mm3) i två steg. Först beräkna voxel-volymen (Vvoxel)(Eq. 1):
(1)
OBS: Enheterna för Dx, Dy och Dslice är i mm. Denna beräkning kan likaledevis utföras för en serie skivor. - Välj de regioner av intresse som ska bestämma provsmakens signalintensitet (μROI)och signalintensiteten (μbrus) och standardavvikelse (σbrus) för en region utanför provet (dvs., bruset). Medelvärdessignalen tas från mitten av bilden, medan brussignalen beräknas från hörnfläckarna (Bild 6). Antingen kan programvaran för spektrometerkontroll eller programvara för allmän bildbehandling användas för dessa beräkningar. Använd en enda repetition om möjligt, för att upprätthålla jämförbarheten mellan olika spolar.
- Använd värdena för att beräkna en volym normaliserad SNR (Eq. 2):
(2)
För den spole som här används i kombination med referenslösningen resulterar användning av Eq. 2 i följande lösning:
(3)
OBS: Vid jämförelse av SNR av spolar vid olika magnetiska fält styrkor, avkoppling egenskaper av fantomen måste mätas23, om inte en mycket lång repetitionstid och mycket kort eko tid används.
- Bestäm volymen normaliserad SNR (SNR/mm3) i två steg. Först beräkna voxel-volymen (Vvoxel)(Eq. 1):
- Kontrollera om det finns problem med mottaglighet på grund av magnetfält inhomogeniteter: ladda och kör en multiple gradient-echo (MGE) sekvens (Bild 7). Magnetfält inhomogeniteter på grund av känslighetsskillnader syns i bilderna med längre ekotider, eftersom gradientens eko inte återfokuserar snurrar, vilket avfasar på grund av statiska fältinhomogeniteter. På så sätt kan inhomogeniteter i provet visualiseras (på grund av luftutrymmen i provet), samt B0 fält inhomogeniteter som införts av spolmaterialet. Använd följande parametrar, som ska justeras beroende på specifikationerna för den spektrometer och spole som används: TR 200 ms, TE 3,5 ms med 48 ekon fördelade 3,5 ms isär, flip vinkel 30 grader. Matrisstorlek 128 x 128.
OBS: Om flera (potentiella) resonant lägen eller reflektion dips observerades i resonans (wobble) kurva, upprepa ovanstående steg för varje resonansläge för att bestämma den mest känsliga. Beroende på mikrospolen kan olika delar av mikrospoleenheten vara benägna att vara oavsiktliga resonanslägen.
(1)
(2)
(3)5. Bildåtergivning med hög upplösning
- Kör ett 3D-FLASH-experiment med följande parametrar: TR 70 ms, TE 2,5 ms, matrisstorlek på 128 x 64 x 64, FOV 1,6 x 0,8 x 0,8 mm, flipvinkel 30°och mottagarens bandbredd 50 kHz.
- Härled pulskrafterna från referenspulseffekten som bestämts tidigare; detta är automatiskt i de flesta bildhanteringsprogram. Bestäm mottagarens förstärkning med hjälp av automatiska justeringar. Justera FOV om det behövs, som täcker hela objektet i båda fas-kodning riktningar för att undvika aliasing. Kör en simulering av lutningstullcykel, om sådan finns på systemet, för att kontrollera att försökets tullcykel håller sig inom specifikationerna för gradientspolarna.
OBS: Dessa parametrar är specifika för spolen som används för demonstration; det är viktigt att optimera till den lokala systemspecifik.
6. Återvinning av prover för vidare studier eller lagring
- Ta bort prov kapillären från mikrospolen.
- Använd pincett, ta bort vaxpluggarna under ett stereomikroskop.
- Använd en spruta för att tvätta provet ur kapillären med en lösning av val. Alternativt, använd en glas skjuterstav för att mata ut provet.
- För att förhindra uttorkning av provet, förvara i ett lämpligt medium för lagring.
Representative Results
Coil Karakterisering
Vid lyckad trimning och matchning av en spole kan dess prestanda karakteriseras av spolen Q-faktor, 90° referenspuls och SNR/mm3. För den 1,5 mm ID-känslighetsmatchade solenoidspolen som demonstrerades här var den uppmätta Q-faktorn(lossad) 244, jämfört med 561 för en 5 mm fågelburspole.
Referensen 90° puls var 12 μs vid en effektnivå på 0,6 W; jfr 5 μs vid 45 W för en 5 mm fågelbursspole (figur 4 och figur 5). Detta motsvarar en RF pulsfältstyrka (B1), med 
hjälp av 0,53 mT för mikrospolen och 1,17 mT för fågelburspolen14 där y är det gyromagnetiska förhållandet, medan tau är pulsens varaktighet. Eftersom pulseffektnivåerna (P) skiljer sig åt, kan spolar jämföras i fråga om sändningseffektivitet 
: 0,69 mT/W1/2 och 0,18 mT/W1/2 för mikrospolen respektive fågelburen14. Om man jämför med en 90° puls, konstateras mikrospole vara en faktor ≈ 4 gånger känsligare än fågelburspolen.
Effekt av känslighetsmatchning
Vid ultrahöga fältstänger blir prov- och spole-mottagligheten en dominerande faktor för bildkvaliteten, vilket kan ses i figur 7A,7B. Jämfört med en spole som saknar en känslighetsmatchande vätskereservoar behålls signalen längre och mer homogent i ett referensprov. På grund av känslighetsbehållaren minskar dock de maximala provdimensionerna med avseende på spolen utan reservoaren.
Högupplöst bildbehandling
En hög upplösning på 13 x 13 x 13 μm3 av ett Medicago-truncatularotexemplar uppnåddes på 20 timmar och 23 minuter (Bild 8). Med utgångspunkt från rotens yta ses rotbarken, tillsammans med lite restvatten på utsidan av roten. Vidare observeras xylem som ett mörkt band som omsluter phloem. Vissa luftfickor observeras som mörka fläckar med fullständig signalförlust.
Symbiotiska rotknutor av M. truncatula kan också avbildas med hjälp av detta protokoll (Figur 9). Med hjälp av en något större oöverträffad spole (längd circa 3500 μm, innerdiameter 1500 μm) erhölls bilder med en upplösning på upp till 16 x 16 x 16 μm3 på 33 minuter.
Bild 1: En magnetmikrobil. (A) Solenoid spole designen består av tråd loopas heliskt, typiskt lindade runt en kapillär. Trådens geometri, såsom dess tjocklek, diameter, antal lindningar, och trådavstånd, påverkar spolens egenskaper. (B) En hembyggd solenoid mikrokyl med en reservoar för känslighet matchande vätska (Fomblin). Den består av en 0,4 mm tjock belagd koppartråd lindad sex gånger runt kapillär med en ytterdiameter på 1500 μm och en spolelängd på 3500 μm. Spolen är nedsänkt i en reservoar som är gjord av en spruta. Prov kapillärer upp till en ytterdiameter på 1000 μm kan införas. Två kondensatorer används, en 1,5 pF kondensator i serie med induktorn och en andra variabel 1,5-6 pF kondensator placeras parallellt med induktorn. Alla komponenter löds till en glasfiberbräda (gul). Den monteras på en handelshållare (grå polymer) som modifieras för att stödja reservoaren. (C) Solenoid spole design komponenter: 1. solenoid spole, 2. prov kapillär, 3. 1.5 pF tuning kondensator, 4. variabel matchande kondensator, 5. glasfiber basplatta, 6. koppar tråd ledningar. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Provberedning under ett stereomikroskop. (A) Poster som behövs för beredning av mikroskopiler. Från vänster till höger: 1. CuSO4 referenslösning, 2. perfluorodecalin, 3. mikrospole, 4. skalpell, 5. positiva spännings pincett, 6. pincett, 7. kapillärer ytterdiameter = 1000 μm, 8. vaxpenna, 9. kapillärvax, 10. nitrilhandskar, 11. stereomikroskop, 12. urglas med Petriskålsöverdrag, 13. växtmaterial i tillväxtsubstrat. Visas inte: 2 mL spruta med ø 0,8 x 40 mm nål och fint mjukpapper. (B) Närbilder av provinfogning i en kapillär med hjälp av pincett, medan båda hålls nedsänkta. (C) Tätning av kapillären med hjälp av smält vax. (D) Införande av den beredda kapillären i mikrospolen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Komponenten i en mikrobildsproben. (A) Micro5 sondbas, innehållande alla nödvändiga anslutningar för vattenkylning, värme, temperaturgivare, gradienteffekt, RF (co-axialkontakt synlig) och valfri sondidentifiering (PICS). Underneath av probbasen finns rattar som möjliggör justering av variabeljusteringen och de matchande kondensatorerna, samt att behålla skruvar för att hålla sonden på plats inuti spektrometern. (B) Den hembyggda mikrospolemontering ovanpå probe-bas. Notera de variabla kondensatorer (vit keramik) monterade på sonden-bas som möjliggör trimning och matchning. (C) Integrerad 3-axiell lutning monterad på sondbasen med vattenkylande kärl och guldpläterade kontakter för jordning av lutningen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4: Nötningskurva. En mutteriseringskurva förvärvas för att bestämma referenspulseffekten. Referenspulseffekten (90° puls) definieras som den kombination av effekt och pulslängd som behövs för att generera ett B1-fält som vänder all tillgänglig magnetisering i z-riktningen till det tvärgående planet. En serie av en puls registreras i avsaknad av lutningskodning. Med varje puls, antingen pulslängd eller pulseffekt är steg. Här sätts pulseffekten på 0,6 W, medan pulslängden ökar med 1 μs varje gång. Den maximala signalintensiteten indikerar 90° pulsen, runt 12 μs. 180° pulsen kan också bestämmas på detta sätt med hjälp av minimiintensiteten. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 5: Visuell bestämning av 90° pulseffekt. När en ungefärlig referenspulseffekt har hittats med hjälp av en nötningskurva, kan den kontrolleras visuellt genom att variera pulslängden. Beroende på spolen kan B1-fältet vara mer eller mindre känsligt för ändringar. (A) 11 μs pulslängd. (B) 12 μs pulslängd, optimal för denna spole. (C) 13 μs pulslängd. (D) 20 μs pulslängd. Om pulseffekten är för hög kan övertippning uppstå och därigenom minska bildintensiteten i mitten av spolen (pilspets). Det ökade B1-fältet ökar också spolens räckvidd, vilket kan observeras i bildens bredd. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Placering av intresseregion. De regioner av intresse (ROI) för volymen normaliserade SNR beräkning kan ses. Medelprovintensiteten tas från en ROI som faller inom referenslösningsprovet. Medelvärdet av buller och standardavvikelse beräknas från en eller flera ROI som finns i bildens hörn. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 7: RF-homogenitet som utvärderas genom toningsekoavbildning. En MGE-sekvens (multiple toningseko) används för att utvärdera RF - (B1 -Field) homogenitet med hjälp av en serie övertoningsekon. Grundläggande parametrar var: repetitionstid 200 ms, ekotid 3,5 ms med antalet ekon 48, ekoavstånd 3,5 ms, 64 genomsnitt, förvärvstid 27 m 18 s, flip vinkel 30°. Synfält var 5 x 5 mm, matris 128 x 128, upplösning 39 x 39 x 200 μm. (A) Mottagligt matchad spole. Den känslighetsmatchande vätskan (Fomblin) som omger RF-spolen minskar känslighetseffekter på grund av spoltråden. Små luftbubblor orsakar signalförlust när ekotiden ökar. (B) En spole (ej mottaglighet matchas) med lika spole diameter. Vid längre ekotider observeras ökande artefakter orsakade av B0-fält inhomogenitet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 8: 3D-avbildning av en Medicago-truncatularotsektion. (Överkant) FLASH-bild. Flera funktioner i rotsektionen kan urskiljas, inklusive epidermis (e), cortex (c), phloem (ph) och xylem (xy). Luftfickor (a) i grundorsaken fullständig signalförlust. Grundläggande parametrar var följande: Repetitionstid 70 ms, ekotid 2,5 ms, 256 genomsnitt, förvärvstid 20 h 23 m. Upplösning 13 x 13 x 13 μm3. Matrisstorleken var 128 x 64 x 64 och synfält 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Mottagarens bandbredd 50 kHz. (Nederkant) MSME-bild. Grundläggande parametrar var följande: Repetitionstid 500 ms, ekotid 5,2 ms, 28 genomsnitt, förvärvstid 15 h 55 m. Upplösning 13 x 13 x 13 μm3. Matrisstorleken var 128 x 64 x 64 och synfält 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Mottagarens bandbredd 70 kHz. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 9: 3D-avbildning av en Medicago truncatula rot nodule. (Överkant) Lågupplöst bild. Grundläggande parametrar var följande: Repetitionstid 60 ms, ekotid 2,3 ms, 4 genomsnitt, förvärvstid 4 m. Upplösning 31 x 31 x 31 μm3. Matrisstorleken var 64 x 32 x 32 och synfält 2 x 1 x 1 mm. Mottagarens bandbredd 50 kHz. (Nederkant) Högupplöst bild. Grundläggande parametrar var följande: Repetitionstid 60 ms, ekotid 2,3 ms, 8 genomsnitt, förvärvstid 33 m. Upplösning 16 x 16 x 16 μm3. Matrisstorleken var 128 x 64 x 64 och synfält 2 x 1 x 1 mm. Mottagarens bandbredd 50 kHz. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Discussion
Detta protokoll är bäst lämpad för biologiska prover, eftersom många material och geologiska prover har betydligt kortare T2 avkopplingstider, som inte kan avbildas av de sekvenser som används här. Även vissa biologiska vävnader, som uppvisar högprov magnetiska känslighet heterogenitet, kan vara svårt att bilden på ultra-högt fält som effekterna är korrelerade till fältet styrka24. Protokollet är inte bara användbart för nya spolar men kan också stöd vid felsökning och diagnos av potentiella problem. När du testar nya eller okända prover kan detta protokoll utföras i förväg på referenslösningen för att verifiera att experimentinställningen fungerar enligt specifikationer. Detta hjälpmedel i felsökning eftersom spektrometern kan uteslutas som en källa till artefakter och funktionsstörningar. Dessutom ställer detta in trim- och matchningskondensatorerna på sonden till värden som är typiska för mikrospolen.
När ingen signal registreras vid det första experimentet kan synfältet för lokalisatorskanningen förstoras för att kontrollera om provet ses. Därefter återkollera om spolen är korrekt inställd och försök till en annan localizer scan. Det är möjligheten, att spolen ställer ut extra unintended resonant lägen, i vilket fall den korrekta måste att vara beslutsam. Om det fortfarande inte går att få någon bild, avlägsna provet för att kontrollera dess läge inom mikrospoleenheten och kontrollera att provet är intakt (dvs. inga luftbubblor eller läckor i tätningarna förekommer). Slutligen kan ett prov beredas med vatten i stället för PFD. I fall provet ger lite detekterbar signal i localizer scan, kan det omgivande vattnet i kapillären fortfarande upptäckas.
Eftersom mikroskopiler är idealiskt mycket nära provet kan de magnetiska känslighetsskillnaderna mellan luften och tråden orsaka ytterligare signalförlust, vilket kan ses i figur 7B. Potentiella artefakter inkluderar spatial mismapping och avvikande signalintensitetsvariation. Speciellt övertoning-echo typ pulssekvenser påverkas av denna icke-enhetliga signalförlust. Av denna anledning presenterade vi en mottaglighet-matchade spole, genom att nedsänka tråden i fluorinert vätska (Fomblin eller FC-43). B 1 uppskattningsmetod som ingår i detta protokoll kan hjälpa till att avgöra om B1 känslighetsskillnader motiverar införandet av känslighet matchning strategier i utformningen av spolen montering. Ett alternativt tillvägagångssätt för att konstruera en mottaglighet matchade spole är att använda känslighet-matchade tråd25. Vidare behandlas endast mottaglighetsfrågor på grund av spolen med detta tillvägagångssätt. Känslighetsfel i provet (t.ex. på grund av luftutrymmen) är fortfarande utmanande.
Luftfickor eller bubblor utgör en experimentell utmaning som orsakar omfattande signalförlust, orsakad av känslighetsskillnader vid luftens gränssnitt och vätskan ellerexemplaret 19 (Figur 5A). En kritisk aspekt av framgångsrik provpreparation är nedsänkningen av både prov och kapillär. Även små bubblor kan dock orsaka signalförluster, särskilt för tonings echo typ sekvenser. Mobila luftbubblor kan migrera genom kapillären tills de har kontakt med provet. Några av dessa effekter kan lindras genom att något luta kapillären så att ena änden är högre än den andra. Tiltning säkerställer att potentiella luftbubblor hålls på plats i den högre änden, utan att störa provet. Det är också viktigt att kontrollera att kapillärvaxet bildar en bra tätning, eftersom uttorkning kan orsaka att stora luftbubblor bildas.
För luftutrymmena inuti provet användes PFD för att fylla upp de intercellulära luftutrymmena samtidigt som de inte trängde in i cellmembranen26. Men även med detta tillvägagångssätt kunde vi inte ta bort alla luftutrymmen. Dessutom innebär detta tillvägagångssätt att vi behöver ytterligare ett medel, vilket vanligtvis inte är att föredra på grund av önskan att studera ett system så noninvasively som möjligt.
Den cylindriska formen av kapillärer innebär att perfusionsuppställningar ska vara livskraftiga, särskilt för vävnader som är sårbara för förfall, såsom biopsier eller studerar processer i levande rotmaterial. Två steg kunde realisera en perfusionsinställning. För det första skulle det vara tillräckligt att ansluta ett medelhögt matningsrör samt ett avloppsrör på vardera sidan av kapillären för att skapa en chemostat. För det andra kunde tillsatsen av ett indrag i provkampillären hålla provet på plats mot flödesriktningen. Detta är analogt med ett protokoll som publicerats för planar mikrokyler10.
Noninvasiv karaktär av MR imaging, kombinerat med inert vätskan som används i detta protokoll (PFD eller Fomblin) medel efter avslutad experiment, prover kan tas bort från sina kapillärer för vidare studier. Kombinationer inkluderar optisk eller elektronmikroskopi och andra destruktiva avbildningstekniker. Vi har nyligen visat en kombination med optisk mikroskopi på Medicago truncatula rot knölar27.
Vi har visat en metod för bildtagning växtmaterial med hjälp av dedikerade mikroskylor på en ultra-hög fält NMR spektrometer. Relativt stora provvolymer kan studeras vid hög upplösning med god RF-homogenitet. Vidare kan spektroskopisk avbildning utföras med högre upplösningar än annars genomförbara. Anpassning av mikrospolens utformning till prover underlättas genom en effektiv metod för att fastställa egenskaper för spolprestanda. Metoden med solenoidspole kan också lätt tillämpas på andra prover än växter, inklusive djurvävnad.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Experiment vid instrumentet 950 MHz stöddes av uNMR-NL, en NWO-finansierad National Roadmap Large-Scale Facility of the Netherlands (projekt 184.032.207). R.S. stöddes av BioSolarCells konsortiumprojekt U2.3. J.R.K. stöddes av Nederländernas kärnresonansforskningsskola (NMARRS) forskarskola [022.005.029]. Vi tackar Defeng Shen och Ton Bisseling för att de tillhandahåller Medicago-truncatulaproverna. Vi tackar vidare Klaartje Houben, Marie Renault, och Johan van der Zwan för teknisk support på uNMR-NL anläggningen. Vi vill också tacka Volker Lehmann, Henny Janssen och Pieter de Waard för teknisk hjälp. Vi uttrycker vår tacksamhet till Frank Vergeldt, John Philippi och Karthick B. Sai Sankar Gupta för deras råd. Slutligen tackar vi Jessica de Ruiter för att ge voice-over till videon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reference solution preparation | |||
| CuSO4 | Sigma-aldrich | 469130 | Crystalline powder for creating reference solution |
| D2O | Sigma-aldrich | 151882 | Liquid used to prepare reference sample |
| Weigh Scale | Sartorius | PRACTUM513-1S | Scale for weighing compounds |
| Sample preparation | |||
| Capillary 1000 μm (Outer diameter) | Hilbenberg GmbH | 1408410 | Sample capillaries |
| Capillary wax | Hampton Research | HR4-328 | Solid wax used to seal samples |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | No. 11 | Used to excise samples |
| Perfluorodecalin | Sigma-aldrich | P9900 | Liquid used for submerging sample |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | Tabletop binocular microscope |
| Syringe | Generic | - | Used to apply PFD and manipulate the sample |
| Vacuum Pump | Vacuubrand | MZ2C | Two-stage membrane vacuumpump used for removing air pockets from samples. |
| Wax pen | Hampton Research | HR4-342 | Handheld wax pen used to melt and apply capillary wax to samples |
| Imaging Hardware | |||
| 22.3 T Magnet | Bruker GmbH | 950 US2 | Narrowbore superconducting magnet |
| Air cooler | Bruker GmbH | - | Used to regulate probe temperature |
| Console | Bruker GmbH | Avance III HD | Controls operation of the spectrometer |
| Micro5 gradient coils | Bruker GmbH | Mic5 | Removable gradient coils mount on the Micro5 probe body |
| Micro5 Probe body | Bruker GmbH | Mic5 | Holds microcoils and gradient coils |
| RF microcoil | Home-built | - | contains Fomblin |
| Vector Network Analyzer | Copper Mountain Technologies | TR1300/1 | Used to perform S11 reflectance test, frequency range 300kHz to 1.3 GHz |
| Water cooler | Bruker GmbH | BCU-20 | Open loop watercooling to dissipate heat from gradient coil operation. |
References
- Ciobanu, L., Pennington, C. H. 3D micron-scale MRI of single biological cells. Solid State Nuclear Magnetic Resonance. 25 (1-3), 138-141 (2004).
- Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
- Radecki, G., Nargeot, R., Jelescu, I. O., Le Bihan, D., Ciobanu, L. Functional magnetic resonance microscopy at single-cell resolution in Aplysia californica. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8667-8672 (2014).
- Lee, C. H., et al. Magnetic Resonance Microscopy (MRM) of Single Mammalian Myofibers and Myonuclei. Scientific Reports. 7 (1), 39496 (2017).
- Callaghan, P. T. Principles of nuclear magnetic resonance microscopy. , Oxford University Press. Oxford. (1994).
- Glover, P., Mansfield, S. P. Limits to magnetic resonance microscopy. Reports on Progress in Physics. 65 (10), 1489-1511 (2002).
- Peck, T. L., Magin, R. L., Lauterbur, P. C. Design and analysis of microcoils for NMR microscopy. Journal of Magnetic Resonance. Series B. 108, 114-124 (1995).
- Lee, C. H., Flint, J. J., Hansen, B., Blackband, S. J. Investigation of the subcellular architecture of L7 neurons of Aplysia californica using magnetic resonance microscopy (MRM) at 7.8 microns. Scientific Reports. 5, 11147 (2015).
- Fratila, R. M., Velders, A. H. Small-Volume Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Annual Review of Analytical Chemistry. 4 (1), 227-249 (2011).
- Flint, J. J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition. Journal of Visualized Experiments. (128), 1-10 (2017).
- Minard, K. R., Wind, R. A. Solenoidal microcoil design. Part I: Optimizing RF homogeneity and coil dimensions. Concepts in Magnetic Resonance. 13 (2), 128-142 (2001).
- Vegh, V., Gläser, P., Maillet, D., Cowin, G. J., Reutens, D. C. High-field magnetic resonance imaging using solenoid radiofrequency coils. Magnetic Resonance Imaging. 30 (8), 1177-1185 (2012).
- Minard, K. R., Wind, R. A. Solenoidal microcoil design Part II: Optimizing winding parameters for maximum signal-to-noise performance. Concepts in Magnetic Resonance. 13 (3), 190-210 (2001).
- Haase, A., et al. NMR probeheads for in vivo applications. Concepts in Magnetic Resonance. 12, 361-388 (2000).
- Webb, A. G. Radiofrequency microcoils for magnetic resonance imaging and spectroscopy. Journal of Magnetic Resonance. 229, 55-66 (2013).
- Peck, T. L., Magin, R. L., Lauterbur, P. C. Design and Analysis of Microcoils for NMR Microscopy. Journal of Magnetic Resonance, Series B. 108 (2), 114-124 (1995).
- Olson, D. L., Peck, T. L., Webb, A. G., Magin, R. L., Sweedler, J. V High-Resolution Microcoil 1H-NMR for Mass-Limited, Nanoliter-Volume Samples. Science. 270 (5244), (1995).
- Oerther, T. Micro Imaging Manual for AV3 Systems. , Bruker Biospin GmbH. Rheinstetten, Germany. (2012).
- Callaghan, P. T. Susceptibility and Diffusion Effects in NMR Microscopy. Encyclopedia of Magnetic Resonance. , (2007).
- Donker, H. C. W., Van As, H., Snijder, H. J., Edzes, H. T. Quantitative 1H-NMR imaging of water in white button mushrooms (Agaricus bisporus). Magnetic Resonance Imaging. 15 (1), 113-121 (1997).
- Tsai, W. T. Environmental property modelling of perfluorodecalin and its implications for environmental fate and hazards. Aerosol and Air Quality Research. 11 (7), 903-907 (2011).
- Keifer, P. A. 90° pulse width calibrations: How to read a pulse width array. Concepts in Magnetic Resonance. 11 (3), 165-180 (1999).
- Vlaardingerbroek, M. T., den Boer, J. A. Magnetic Resonance Imaging: Theory and Practice. , Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg. 05252-05255 (2003).
- Schenck, J. F. The role of magnetic susceptibility in magnetic resonance imaging: MRI magnetic compatibility of the first and second kinds. Medical Physics. 23 (6), 815-850 (1996).
- Kc, R., Henry, I. D., Park, G. H. J., Aghdasi, A., Raftery, D. New solenoidal microcoil NMR probe using zero-susceptibility wire. Concepts in Magnetic Resonance Part B: Magnetic Resonance Engineering. 37 (1), 13-19 (2010).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).
- van Schadewijk, R., et al. Magnetic Resonance Microscopy at Cellular Resolution and Localised Spectroscopy of Medicago truncatula at 22.3 Tesla. Scientific Reports. 10 (1), 971 (2020).
