Summary
I dette arbejde leverer vi en protokol til biofunktionalisering af magnetiske nanomaterialer med antistoffer til specifik cellemålretning. Som eksempler bruger vi jern nanotråde til at målrette kræftceller.
Abstract
Magnetiske nanomaterialer har fået stor opmærksomhed i forskellige biomedicinske anvendelser. Biofunktionalisering af disse nanomaterialer med specifikke målretningsmidler er et afgørende aspekt for at forbedre deres effektivitet i diagnostik og behandlinger, samtidig med at bivirkningerne minimeres. Fordelen ved magnetiske nanomaterialer sammenlignet med ikke-magnetiske er deres evne til at reagere på magnetfelter på en kontaktfri måde og over store afstande. Dette gør det muligt at guide eller akkumulere dem, mens de også kan overvåges. For nylig blev magnetiske nanotråde (NW'er) med unikke funktioner udviklet til biomedicinske applikationer. Det store magnetiske moment af disse NW'er muliggør en mere effektiv fjernbetjening af deres bevægelse med et magnetfelt. Dette er blevet brugt med stor succes inden for kræftbehandling, lægemiddellevering, cellesporing, stamcelledifferentiering eller magnetisk resonansbilleddannelse. Derudover giver NW-fabrikationen ved skabelonassisteret elektrokemisk aflejring en alsidig metode med tæt kontrol over NW-egenskaberne. Især jern NW'er og jern-jernoxid (kerne-shell) NW'er er velegnede til biomedicinske anvendelser på grund af deres høje magnetisering og lave toksicitet.
I dette arbejde leverer vi en metode til at biofunktionalisere jern/jernoxid NW'er med specifikke antistoffer rettet mod en specifik celleoverflademarkør, der er overudtrykt i et stort antal kræftceller. Da metoden udnytter jernoxidoverfladens egenskaber, er den også anvendelig til superparamagnetiske jernoxidnanopartikler. NW'erne er først belagt med 3-aminopropyl-tri-ethoxy-silan (APTES), der fungerer som en linker, som antistofferne er kovalent bundet til. APTES-belægningen og antistofbiofunktionaliseringen er bevist ved elektronenergitabsspektroskopi (EELS) og zetapotentialemålinger. Derudover testes antigeniciteten af antistofferne på NW'erne ved anvendelse af immunudfældning og western blot. Den specifikke målretning af de biofunktionaliserede NW'er og deres biokompatibilitet undersøges ved konfokal mikroskopi og et cellelevedygtighedsassay.
Introduction
En unik egenskab ved magnetiske nanomaterialer er deres evne til at reagere på magnetfelter1, som med fordel kan udnyttes til at aktivere dem på mange måder, mens de også kan overvåges for eksempel ved magnetisk resonansbilleddannelse (MRI). Ved anvendelse af et vekslende magnetfelt ved høj frekvens kan de generere varme, hvilket kan fremkalde hypertermi, hvilket giver en terapeutisk mulighed1. En anden tilgang er fototermisk behandling, som kan realiseres med en nær infrarød (NIR) laser 2,3.
Blandt det store antal magnetiske nanomaterialer har jernoxid fået størst opmærksomhed i biologiske applikationer såsom magnetisk separation, hypertermi2,4, cellevejledning5, lægemiddelafgivelse 6,7,8 og som kontrastmiddel i MR 9,10. Dette skyldes deres høje biokompatibilitet 11,12, stor magnetisering 11,12, evne til at blive belagt 9,13,14,15, evne til at bære stoffer 2,16, evne til at blive funktionaliseret med lægemidler2,16 eller / og målretningsmidler 12,13,17,18, og evne til at konvertere optisk energi til varme2. For nylig startede MagForce i kliniske forsøg med kræftpatienter, der bruger jernoxidnanopartikler til hypertermibehandling19.
På det seneste er magnetiske nanotråde (NW'er) i stigende grad blevet udnyttet til biomedicinske applikationer 3,11,16,20,21,22. De har lignende egenskaber som magnetiske nanoperler, men tilbyder en anisotrop form og et meget stort magnetisk moment, hvilket muliggør en meget effektiv fjernbetjening af et magnetfelt23,24, inklusive lavfrekvent aktivering for at inducere magnetomekaniske effekter 25,26,27,28,29. Som følge heraf er NW'erne blevet implementeret til forskellige biologiske anvendelser såsom exosomisolering30 cellesporing 21, kræftbehandling 3,11,16, lægemiddelafgivelse 16,31,32 og som et MR-kontrastmiddel 33.
Biofunktionaliserede magnetiske nanomaterialer med specifik cellemålretningsevne har stort potentiale for biomedicinske anvendelser og inden for præcisionsmedicin34,35. For at fastgøre disse målretningsmidler kræves der en overfladeændring på nanomaterialerne. Typisk har de brug for en belægning, der giver en funktionel gruppe, som letter fastgørelsen af behandlingsmidlerne. I litteraturen er der et stort antal organiske og uorganiske belægninger til magnetiske nanomaterialer. Baseret på den funktionelle gruppe, der kan immobiliseres til nanomaterialet, kan disse belægninger kategoriseres i fire hovedgrupper: molekyler baseret på carboxylsyregrupper, polymerer, histidin og molekyler baseret på silangrupper.
Molekylerne baseret på carboxylsyregrupper er en af overflademodifikationsmetoderne. Det udnytter den høje affinitet
mellem den negative carboxylsyregruppe på belægningen og den positive ladning på de magnetiske nanomaterialer36,37,38. Bindingsprocessen af en carboxylsyre til en metaloverflade kan involvere dannelsen af metalcarboxylatsalte eller vedhæftning af carboxylgruppen til metallet. For multisegmenterede NW'er, såsom jern / guld eller nikkel / guld NW'er, som har fremragende egenskaber til bioapplikationer39,40, kan denne type belægning imidlertid ikke påføres let. Det kræver to forskellige belægninger på samme tid: thiolgrupper til ændring af guldsegmenterne og carboxylgrupper til magnetiske segmenter (jern eller nikkel)38. Nogle eksempler på molekyler baseret på carboxylgrupper er hæmatoporfyrin, pimelsyre, palmitinsyre og 3-[(2-aminoethyl) dithio] propionsyre (AEDP)38. Overflademodifikationer af magnetiske nanomaterialer ved hjælp af polymerer giver nogle klare fordele. På grund af polymerernes store molekylvægt forbedrer det stabiliteten af det magnetiske nanomateriale i en opløsning38. Det vil imidlertid øge nanomaterialets størrelsebetydeligt 38. Polyvinylpyrrolidon (PVP), polyethyleneimin (PEI), arginin-glycin-D asparaginsyre (RGD) og polyethylenglycol (PEG) er nogle eksempler på de mest almindeligt anvendte polymerer til overflademodifikationer. Hver enkelt har sine egne funktioner og bruger38. Den tredje overflademodifikationsmetode er anvendelse af en histidinbelægning. Histidin er et protein med en histidinaminosyresidekæde, der har en høj affinitet til et begrænset antal magnetiske nanomaterialer såsom nikkel38. Det kan anvendes til proteinrensningsprocesser 38,41,42. En histidinbelægning kan også påføres multisegmenterede NW'er, såsom nikkel / guld NW'er38. Silanisering af en nanomaterialeoverflade er en veletableret proces 38,43,44. Det er baseret på et siliciumatom bundet til enhver metaloxidoverflade gennem tre enkeltbindinger, og samtidig binder dette siliciumatom til den funktionelle gruppe i slutningen gennem en alkylkæde 38,43,44. Fordelen ved denne belægning er at tilvejebringe frie amingrupper, og den har evnen til at belægge både magnetiske og ikke-magnetiske materialer38,45, såsom henholdsvis nikkel og guld. Derfor er anvendelse af molekyler baseret på saltvandsgruppen en praktisk rute til biofunktionalisering af multisegmenterede NW'er. Nogle eksempler på molekyler baseret på silangrupper er (3-aminopropyl) triethoxysilan (APTES) og (3-aminopropyl) trimethoxysilan (APTMS)38,45.
Tilsætningen af et målretningsmiddel til belægningen kan spille en væsentlig rolle i både diagnose og behandling af syge celler og samtidig minimere bivirkningerne på sundt væv46,47. Tilsætningen af et målretningsmiddel på overfladen af nanomaterialer forbedrer både cellulær selektiv binding og internalisering gennem endocytosereceptorer7. Uden disse målretningsligander interagerer nanomaterialer uspecifikt med cellemembraner, som binder med en lavere hastighed sammenlignet med nanomaterialerne med liganderne48. En af udfordringerne ved at målrette kræftvæv er deres karakteristiske lighed med sundt væv. Derfor afhænger målretningens succes hovedsageligt af at bestemme den passende ligand, der skal bruges som et biologisk mål49,50. Forskellige målretningsmidler er blevet anvendt til at dirigere nanomaterialer til kræftceller48,51 (f.eks. CD44 på grund af dets høje ekspression i kræftceller sammenlignet med raske celler52,53,54,55).
Målretningsagenter kan kategoriseres i tre hovedgrupper baseret på de komponenter, de er lavet af, og deres kompleksitet: aptamerbaseret målretning, ligandbaseret målretning og antistofbaseret målretning. Aptamerer er korte kemisk syntetiserede strenge af DNA eller RNA-oligonukleotider, der foldes i to- og tredimensionelle strukturer, hvilket gør dem i stand til at målrette mod et specifikt antigen, oftest proteiner56. Ligandbaseret målretning omfatter peptider og korte aminosyrekæder57. Antistofbaseret målretning indebærer anvendelse af et helt antistof eller antistoffragmenter, såsom enkeltkædede variable fragmenter eller antigenbindende fragmenter51. Brug af denne metode har den fordel, at den besidder to bindingssteder med en høj bindingsaffinitet til dets specifikke målantigen, hvilket giver det en overordentlig høj selektivitet58. Bindingsstederne er analoge med en lås og antigenet med en nøgle58.
I dette arbejde blev de anvendte NW'er fremstillet ved elektrodeposition på aluminiumoxidmembraner, en metode beskrevet detaljeret i en tidligere publikation59. Fokus her er på at frigive disse jern-jernoxid (kerne-shell) NW'er fra membranerne og biofunktionalisere dem med specifikke antistoffer for at give en målretningsevne. Antistofferne kan ikke binde direkte til jern-jernoxid NW'erne og kræver en linker. Belægning af NW'erne med APTES giver frie amingrupper, der muliggør kovalent binding via carboxylgruppen på antistofferne (figur 1). Fordelen ved APTES-belægningen er dens evne til at arbejde for både magnetiske21 og ikke-magnetiske60-materialer , såsom jern / guld eller nikkel / guld NWS45. Alle belægnings- og biofunktionaliseringstrin, der er forklaret i denne protokol, kan generelt anvendes med ethvert jern / jernoxidnanomateriale. Jern / jernoxid NW'er blev brugt her som et eksempel. Resultaterne viser, at de antistoffunktionaliserede NW'er har en høj antigenicitet over for specifikke celleoverfladereceptorer, som kan bruges til forskellige applikationer. Eksempler omfatter celleseparation, lægemiddelafgivelse, specifik kræftcellebehandling ved hjælp af fototermiske og / eller magnetomekaniske behandlinger.
Protocol
FORSIGTIG: Se altid alle relevante sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Brug alle relevante sikkerhedspraksisser og personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, handsker, laboratoriefrakke, bukser i fuld længde, sko med lukket tå). Udfør alle biologiske reaktioner i den biologiske damphætte.
BEMÆRK: Denne protokol er beregnet til at producere 2 x 10 10 biofunktionaliserede NW'er / ml svarende til 0,36 mg jern / ml belagt med anti-CD44-antistoffer med en densitet på 3 x10 4 antistoffer / NW. Jern-jernoxid (kerneskal) NW'erne er 2,5 μm lange og har en diameter på 41,5 nm.
1. Frigivelse af jern nanotråde
BEMÆRK: Fremstillingsprocessen for jern/jernoxid NW'er blev forklaret detaljeret i en tidligere publikation59.
- På en skæremåtte skæres aluminiumsskiverne (Al) (figur 2A) i små stykker (figur 2B) ved hjælp af et enkelt kantblad og en lille hammer, der passer ind i et 2 ml rør. Brug pincet til at overføre de små Al-stykker til røret.
- Fyld 2 ml glasset, der indeholder de små Al-stykker, med 1 ml 1 M natriumhydroxid (NaOH). Sørg for, at alle Al-stykkerne er dækket af NaOH.
- Lad opløsningen virke i 30 minutter ved stuetemperatur inde i en kemisk stinkhætte.
- Fjern kun Al-stykkerne ved hjælp af pincetten, og opbevar de frigjorte NW'er (sorte klynger, figur 3A) i NaOH-opløsningen i yderligere 30 minutter. Du må ikke ændre NaOH-opløsningen.
- Opsaml NW'erne ved at placere 2 ml røret i et magnetstativ og vent i 2 minutter, før du fjerner den gamle 1 M NaOH-opløsning. Udskift den med frisk NaOH-opløsning.
- Sonikere 2 ml røret indeholdende NW'erne i 30 s og lad det stå i 1 time inde i en kemisk damphætte.
- Gentag trin 1.5-1.6 mindst fire gange.
- Vask NW'erne ved at placere 2 ml røret i magnetstativet og vent i 2 min.
- NaOH-opløsningen kasseres, og den erstattes med 1 ml absolut ethanol.
- Sonikere røret i 30 s.
- Placer 2 ml røret i magnetstativet og vent 2 min.
- Kassér den gamle absolutte ethanolopløsning og erstat den med 1 ml frisk absolut ethanol og sonikat i 30 s.
- Gentag trin 1.11 og 1.12 mindst fire gange.
- Opbevar NW'erne i 1 ml absolut ethanol ved stuetemperatur, indtil de skal bruges.
- Mål koncentrationen af jern og dermed NW'erne ved hjælp af induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS).
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Ved langtidsopbevaring skal du dog ikke frigive NW'erne fra Al-skabelonen, før det er nødvendigt. At holde de frigivne NW'er, der udfældes i ethanolen i lang tid uden hyppig sonikering, vil skabe aggregeringer, der har brug for længere tider med sonikering, der skal adskilles.
2. Overtrækning af nanotrådene med APTES
BEMÆRK: I denne protokol er 100 μL APTES-opløsning (densitet på 0,946 g / ml61) nok til at belægge 1,6 x 107 m2 / g NW'er. Hvis der sker en ændring i forholdet eller massen af nanomaterialet, bør APTES-volumenet justeres i overensstemmelse hermed.
- Overfør NW'erne fra trin 1.14 til et 5 ml glasrør ved hjælp af en 1 ml pipette.
- For at opsamle eventuelle NW'er, der er tilbage i 2 ml røret, skal du vaske det tomme 2 ml rør to gange ved at tilsætte 1 ml absolut ethanol og overføre det til 5 ml glasrøret ved hjælp af en 1 ml pipette.
- Ved hjælp af pipetten tages 100 μL APTES og tilsættes direkte til NW-opløsningen.
- Vortex 5 ml glasrøret til 10 s.
- Juster 5 ml glasrøret på klemmen på et laboratorieretortstativ.
- Placer halvdelen af 5 ml glasrøret inde i ultralydsbadets vand og sonikere i 1 time.
- Tag 5 ml glasrøret ud af ultralydbadet og tilsæt 400 μL deioniseret (DI) vand efterfulgt af 20 μL 1 M NaOH (basisk katalyse).
FORSIGTIG: Det er vigtigt at tilføje DI-vandet først. - Juster 5 ml glasrøret, som forklaret i trin 2.5-2.6, og soniker i yderligere 1 time.
- Tag 5 ml glasrøret ud af ultralydbadet.
- Placer en magnet ved siden af glasrøret i 5 minutter for at opsamle NW'erne.
- Supernatanten erstattes med 1 ml frisk absolut ethanol og sonikat i 10 sekunder.
- Gentag trin 2.10-2.11 fire gange.
- Overfør al NW's suspenderede ethanol til et nyt 5 ml glasrør ved hjælp af en 1 ml pipette.
BEMÆRK: De APTES-coatede NW'er kan opbevares i et glasrør med ethanol, indtil de er nødvendige. Protokollen kan sættes på pause her.
3. Biofunktionalisering af nanotrådene
- Aktivering af antistofferne
BEMÆRK: For at opnå ca. 3 x 104 dele antistof/NW skal du bruge 30 μL antistof (1 mg/ml) pr. 0,1 mg jern.- I et 2 ml rør opløses 0,4 mg 3-3-dimethylaminopropylcarbodiimid (EDC) og 1,1 mg sulfo-N-hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS) i 1 ml 2-N-morpholino ethanesulfonsyrehydrat (MES) (pH 4,7).
BEMÆRK: EDC / sulfo-NHS-blandingen skal være frisk og tilberedt før brug. - I et nyt 2 ml rør tilsættes henholdsvis 30 μL anti-CD44-antistof (1 mg / ml), 960 μL 0,1 M fosfatbufret saltvand (PBS, pH 7) og 10 μL EDC / sulfo-NHS-blanding (fremstillet i trin 3.1.1).
- Anbring 2 ml røret i en rørryster ved 10 x g i 15 minutter ved stuetemperatur.
- I et 2 ml rør opløses 0,4 mg 3-3-dimethylaminopropylcarbodiimid (EDC) og 1,1 mg sulfo-N-hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS) i 1 ml 2-N-morpholino ethanesulfonsyrehydrat (MES) (pH 4,7).
- Fremstilling af APTES-coatede nanotråde
- Under inkubationen på 15 minutter i trin 3.1.3 vaskes NW'erne ved at placere en magnet ved siden af det APTES-belagte NWS-rør (fra trin 2.13) i 2 minutter for at opsamle NW'erne.
- Kassér ethanolen og erstat den med 1 ml 0,1 M PBS (pH 7), og soniker derefter i 10 s.
- Gentag trin 3.2.1-3.2.2 fire gange.
- Saml NW'erne som forklaret i trin 3.2.1, og kassér 0,1 M PBS. Opbevar NW'erne i røret uden nogen løsning.
- Fastgørelse af antistofferne
- Al aktiveret antistofopløsning (fremstillet i trin 3.1.3) overføres til NWS-røret (fremstillet i 3.2.4) og sonikeres i 10 s.
- Glasrøret anbringes i rotatoren natten over ved 4 °C.
- NW'erne opsamles ved hjælp af en magnet som beskrevet i trin 3.2.1, og supernatanten kasseres.
- Der tilsættes 1 ml 2 % bovin serumalbuminopløsning (BSA) i 1 time ved 4 °C for at blokere reaktionen.
- Kontroller antigeniciteten af antistoffunktionaliserede NW'er, for eksempel ved hjælp af immunoprecipitation (IP) og western blot (WB) assays.
BEMÆRK: For bedre resultater skal du bruge de biofunktionaliserede NW'er i IP-, WB- eller biokompatibilitetsanalysen umiddelbart efter blokeringstrinnet.
4. Biokompatibilitetsanalyse
BEMÆRK: For at studere NW'ernes biokompatibilitet kan forskellige cellelevedygtighedsassays og forskellige cellelinjer anvendes. Koncentrationen af de NW'er, der anvendes her, er baseret på en tidligere publikation16. Cellesåningen skal udføres en dag før NW-biofunktionaliseringen.
FORSIGTIG: Alle nedenstående trin skal udføres under biosikkerhedsskabet.
- I en 96-brøndplade frø ni brønde med 4 x 104 tyktarmskræftceller (HCT116-cellelinje) suspenderet i McCoys cellekulturmedier (100 μL / brønd) og placer den inde i inkubatoren natten over ved 37 ° C og 5% kuldioxid (CO2).
- NW'erne vaskes (fra trin 3.3.4) med PBS ved at opsamle dem ved hjælp af en magnet som i trin 3.2.1, og den gamle opløsning erstattes med 1 ml 0,01 M PBS (pH 7). Gentag dette trin tre gange.
- Vask NW'erne (fra trin 4.2) med opvarmede McCoys medier ved at samle dem ved hjælp af en magnet som i trin 3.2.1, og erstat den gamle PBS med 1 ml opvarmet McCoys medier. Gentag dette trin tre gange.
- Indsamling af NW'er (fra trin 4.3) ved hjælp af en magnet som i trin 3.2.1 og erstat 1 ml opvarmet McCoys medier med 900 μL opvarmede McCoys medier. NWS-koncentrationen bør være 0,02 mg NW'er pr. ml.
- Tag 96-brøndpladen (fra trin 4.1) fra inkubatoren til biosikkerhedsskabet.
- Kassér det gamle medie fra cellerne under biosikkerhedsskabet og udskift det med 100 μL suspenderede NW'er (fremstillet i trin 4.4).
- Pladen (tilberedt i trin 4.6) rystes i hånden og inkuberes derefter i 24 timer inde i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2.
- Den næste dag skal du tage 96-brøndpladen (forberedt i trin 4.7) ud af inkubatoren. Under biosikkerhedsskabet tilsættes 11 μL af cellelevedygtighedsreagenset (materialetabel) til hvert hul ved hjælp af multivægpipetten.
- Ryst pladen med pladerysteren med en hastighed på 10 x g i 10 s.
- Inkuber pladen i 1 time i inkubatoren.
- Tag 96-brøndpladen (forberedt i trin 4.10) ud af inkubatoren. Pladen i mikropladelæseren (materialefortegnelsen) aflæses ved at måle absorbansen af reagenset for cellelevedygtigheden (excitation 540 nm, emission 590 nm).
Representative Results
Det er vigtigt at skære aluminiumsskiverne (Al) (figur 2A) i små stykker (figur 2B), så de passer ind i det anvendte rør. Efter tilsætning af 1 M NaOH til Al-stykkerne skal en reaktion starte straks, hvilket observeres ved dannelse af bobler. Hvis der ikke opstår nogen reaktion på 1 min, eller hvis reaktionen er meget hurtig, og opløsningen bliver helt uklar med en hvid sky, skal du straks fjerne den gamle NaOH-opløsning og erstatte den med en frisk opløsning. Kontroller pH-værdien af NaOH-opløsningen. Det skal være pH>12. Når NW'erne frigives fra Al-stykkerne i de første 30 minutter med NaOH, vil NW'erne (sorte klynger, figur 3A) flyde i NaOH-løsningen. I det sidste trin med frigivelse af NW'erne skal opløsningen være homogen. Der bør ikke være nogen klynge af NW'er (figur 3B). Hvis NW'er blev opsamlet med en magnet i 3 minutter, skal opløsningen være klar, og NW-pelleten skal være sort (figur 3C). Hvis pelleten var grå, kasseres røret og starter igen med en ny Al-prøve.
Under frigivelsesprocessen opnår NW'erne et naturligt jernoxidlag med omkring 5 nm tykkelse, hvilket svarer til tidligere rapporter11,16,20. Dette oxidlag har et vigtigt bidrag til biokompatibiliteten 16, funktionalisering16,18 og magnetiske egenskaber20 af NW'erne. Men at holde NW'erne i deres skabelon (dvs. ikke frigive dem), indtil det er nødvendigt, vil forhindre dem i nogen miljøpåvirkning på dem. Den gennemsnitlige diameter og længde af NW'erne efter frigivelsesprocessen var henholdsvis 2, 5 μm og 41, 5 nm. Massen af en enkelt NW kan beregnes som forklaret i tabel 1 og bekræftes ved induktivt koblet plasmamassespektroskopi (ICP-MS). Her indeholdt hver aluminiumoxidskive ca. 0,3 mg jern.
For at reducere aggregeringen af NW'erne efter frigivelse og muliggøre yderligere funktionalisering blev NW'erne belagt med APTES. Denne belægning giver frie amingrupper og har evnen til at belægge både magnetiske og ikke-magnetiske materialer39,45, hvilket gør den velegnet til belægning af multisegmenterede NW'er såsom jern / guld NW'er. Under nanowires belægning er det vigtigt at fokusere på to ting. Først beregnes det nødvendige volumen fra APTES-molekyler62 baseret på overfladearealet og massen af NW'erne. Disse beregninger fremgår af tabel 2. For det andet skal nanotrådene holdes i en kontinuerlig bevægelse for at forhindre deres agglomerering og blokering af nogle dele af NW-overflader fra APTES-belægning. For eksempel blev nanotrådene i denne protokol inkuberet under ultralydbadet og rotatoren under henholdsvis APTES-belægningen og antistoffunktionaliseringen. Hvert APTES-molekyle indeholder et siliciumatom og en terminal funktionel amingruppe21. Derfor kan elektronenergitabsspektroskopi (EELS) kort bruges til at bekræfte tilstedeværelsen af APTES-belægningen ved at vise siliciumatomer (lyserød farve) på NW-overfladen (figur 4A). I modsætning hertil viser de ikke-coatede NW'er jernatomerne i barkblå (figur 4B) og jern/iltblandingsatomer i lyseblå (figur 4B). Den tilsvarende EELS-kortlægning af ikke-coatede NW'er (figur 4C,4D) viser en højere intensitet af jern vs. ilt i midten (figur 4C) end på overfladen (figur 4D), hvilket indikerer en jern-jernoxid (kerne-skal) struktur. Ålekortlægningen (figur 4C,4D) blev identificeret, at jernoxidlaget på NW'erne erFe3O4mere end Fe2O3, hvilket svarer tilen tidligere publikation20.
Antigeniciteten af de vedhæftede antistoffer kan bekræftes ved hjælp af IP- og WB-assays, hvor der kan observeres et bånd på den positive prøve, men ikke på de negative kontroller (figur 5). Bemærk, at for at observere et klart bånd må du ikke bruge mindre end 0,1 mg NW'er/10 x 106 celler. BCA-assay (materialetabel) i kombination med nogle beregninger præsenteret i tabel 3 blev brugt til at kvantificere antistofnummeret på NW.
Desuden blev zetapotentialemålingen brugt til at belyse overfladefunktionaliseringen. Den terminale amingruppe på APTES reducerede den negative ladning af de ikke-coatede NW'er, som vist i figur 6. De antistoffunktionaliserede NW'er ændrede også ladningen sammenlignet med de APTES-coatede NW'er (figur 6). Alle zeta-potentialmålinger blev udført ved pH 7.
Den specifikke cellemålretning af de antistoffunktionaliserede NW'er kan bekræftes ved hjælp af konfokalmikroskopi (figur 7). Biokompatibiliteten af ethvert nyt nanomateriale bør testes, inden en ansøgning påbegyndes. Derfor blev cellelevedygtighedsanalysen anvendt, og det bekræftede, at de ikke-overtrukne, APTES-belagte og antistofbelagte NW'er var biokompatible selv med en høj koncentration (figur 8).
Figur 1: Skematisk repræsenterer nanotrådenes belægnings- og biofunktionaliseringsmetode. (A) Overtrækning af NW'er af jern med APTES. (B) Aktivering af antistofferne ved hjælp af EDC + Sulfo-NHS, for at have i slutningen (C) et antistof funktionaliseret nanowire. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Jernaflejret aluminiumsskive. (A) Aluminiumsskiven før skæringen. (B) De røde linjer viste, hvor skiven skulle skæres. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Trin til frigivelse af nanotråd. (A) Klynger af nanotråde flyder i NaOH-opløsning. Billedet blev taget 10 minutter efter tilsætning af NaOH og efter fjernelse af Al-membranen. B) Nanotråde suspenderet i ethanol. Billedet blev taget i det sidste frigivelsestrin, umiddelbart efter sonikeringstrinnet. (C) Sort nanowire pellet opsamlet af en magnet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kort over elektronenergitabsspektroskopi (EELS). A) APTES-belagt nanotråd (APTES-NW). De blå og lyserøde farver repræsenterer henholdsvis jern- og siliciumatomer. B) Ikke-coated nanotråd (NW). De barkblå og lyseblå farver repræsenterer henholdsvis jern- og jern/iltblandingskortlægningen. Den tilsvarende EELS-kortlægning af (C) kernen og (D) skallen af de ikke-coatede NW'er. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Bekræftelse af funktionalisering og aktivitet af antistofkonjugerede nanotråde. CD44-NW's antigenicitet blev bekræftet ved anvendelse af immunudfældning (IP) og western blot (WB). +Ve: repræsenterer den positive kontrol (fuldcellelysat). -Ve: repræsenterer den negative kontrol (kun ikke-coated NW). - CD44-celler: repræsenterer celler, der ikke udtrykker CD44-antigen; + CD44-celler: repræsenterer tyktarmskræftceller, der udtrykker CD44-antigen. Dette er en repræsentativ blottelse af n = 3 uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Zeta-potentielle værdier for NW'er, APTES-NW'er og antistof. Søjlerne repræsenterer den gennemsnitlige ± standardfejl. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Konfokale mikroskopiske billeder viser den specifikke målretning. CD44-NW'er er vist vedhæftning (A og C), mens Isotype-NW'erne (negativ kontrol) ikke vedhæftede (B og D). De røde, blå og grønne farver repræsenterer henholdsvis cellemembranen, kernen og klyngen af CD44-NW'er. A og B er de lyse feltbilleder af henholdsvis C og D. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Cellelevedygtighedsundersøgelse af tyktarmskræftceller (HCT116) inkuberet med forskellige formuleringer af nanotråde. Cellerne blev behandlet med NW'er efter 24 timers inkubation og derefter inkuberet i 24 timer med NW'erne. Alle forsøgene blev udført inde i en inkubator ved 37 °C. Søjlerne repræsenterer den gennemsnitlige ± standardfejl. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Parameter | Værdi | Enhed | ||
| Længde af Fe NW (h) | 2.6 | μm | ||
| Radius (diameter/2) (r) | 0.01679231 | μm | ||
| Fe massefylde (D) | 7.87 | g/cm3 | ||
| 1 Fe NW volumen (V)= π r^2h | 2.30E-15 | cm3 | ||
| 1 Fe NW masse = V x D | 1.80E-08 | μg | ||
| 1 Fe NW overfladeareal = 2π r^2 + 2πrh | 2.76E-01 | μm2 | 2.8E+05 | NM2 |
Tabel 1: Beregning af jernets NW-masse.
| Parameter | Værdi | Enhed |
| Massefylde af APTES/100 μL* | 9.50E-01 | g |
| Molekylets bredde (MW) af APTES | 2.21E+02 | g/mol |
| Antal APTES-mol = masse/MW | 4.29E-03 | mol |
| Antal APTES-molekyler/100 μL** | 2.57E+21 | Molekyler |
| APTES størrelse *** | 5.00E-01 | Nm |
| APTES overfladeareal | 2.00E-01 | NM2 |
| NW overfladeareal**** | 2.76E+05 | NM2 |
| Antal NW'er i 0,3 mg NW **** | 1.70E+10 | Nws |
| Antal APTES-molekyler, der er nødvendige for at skabe et lag omkring NW | 1.38E+06 | APTES-molekyle |
| Antal APTES-molekyler, der er nødvendige for 0,3 mg NW'er | 2.35E+16 | APTES-molekyle |
| *Refrence nummer 61 | ||
| ** Antal molekyler = Antal mol*avogadro antal (6E+23) | ||
| Refrence nummer 62 | ||
| Fra tabel 1 | ||
Tabel 2: Beregning af antallet af APTES-molekyler, der kræves til NWS-belægning.
| Y-formet IgG-antistof | NW | |
| Masse for et antistof | 2.3E-13 μg | 1.8E-08 μg* |
| Overfladeareal for et antistof | 23 nm2 | 2,6E+05 nm2 |
| Baseret på BCA-analyse | 0,3 mg pr. 1 mg | |
| Antallet af antistofmolekylet og NW i 0,3 mg antistof pr. mg NW | ~1E+15 antistoffer ** pr. ~5,6E+10 NW'er | |
| Antal antistofmolekyler pr. NW | ~2E+04 antistoffer pr. 1 NW*** | |
| *Beregnet ud fra tabel 1 | ||
| **Antallet af antistoffer i 0,3 mg blev beregnet ved at dividere det antistofantal, vi modtog fra BSA-analysen (0,3 mg), med den gennemsnitlige molekylvægt af Y-formede IgG-antistoffer (180 kDa = 3E-16 mg). | ||
| Baseret på overfladearealet af et molekyle Y-formede IgG-antistoffer (~ 23 nm2) og overfladearealet af en NW (~ 2,6E + 05 nm2) ville omkring 1E + 04 antistoffer være nok til at skabe et monolag på NW. I vores tilfælde var densiteten af antistof to gange mere end den forventede mængde. Dette kan relateres til APTES-belægningen, der giver flere arme, der tillader høj fastgørelse af antistofferne. Denne sag sikrer, at NW er fuldt dækket af antistofferne, og muligheden for, at antistoffet binder til et celleoverfladeantigen, uanset NW'ernes orientering, vil være høj. Men hvis antistofdensiteten er lavere end det forventede antal (1E + 04 antistofmolekyle), vil bindingschancen mellem cellen og NW'erne være lavere. | ||
Tabel 3: Beregning af antallet af antistoffer på nanotråden.
Discussion
Som med enhver nanomaterialefremstillings- og belægningsmetode kræves en høj kvalitet af de anvendte opløsninger. Frigivelses- (1 M NaOH) og funktionaliseringsløsninger (MES) kan genbruges flere gange. Det er dog meget vigtigt at kontrollere deres pH-værdi, inden du starter en ny proces. I frigivelsestrinnet skal vask af NW'erne med NaOH udføres mindst fire gange. Jo bedre vask, jo bedre stabilitet af NW'erne og jo mindre er de aggregerede. Oxidlaget forbedrer NW'ernes stabilitet ved nedsænkning i ethanol eller vand63.
Diameteren og længden af NW'erne blev påvirket efter belægning med APTES og antistoffer. Her steg diameteren fra 41, 5 nm til 70 nm, og længden faldt fra 2, 5 μm til 1, 6 μm på grund af sonikeringstrinnene, der bryder NW'erne. Derfor er det vigtigt karakterisere NW'ernes morfologi efter biofunktionaliseringstrinnet.
Fastgørelsen af antistofferne til NW'erne afhænger af den kovalente interaktion mellem amingruppen (på APTES) og carboxylgruppen (på antistoffet). Derfor er bekræftelse af tilstedeværelsen af APTES-belægningen et vigtigt skridt, som vi brugte EELS-kortlægning til. Belægningsmetoden er sikker og ligetil. Det behøver ikke høje temperaturer eller lange inkubationstider. APTES-belægning fungerer også som en linker for at muliggøre kovalent binding af andre antistoffer eller proteiner, der har en carboxylgruppe.
I tilfælde af biofunktionalisering af NW'erne med et antistof kan antigeniciteten af antistoffernes bindingssteder efter biofunktionaliseringsprocessen påvirkes. IP- og WB-metoden kan bruges til at undersøge dette problem. Brug af biofunktionaliseringsmetoden nævnt i denne protokol vil gøre det muligt for antistofferne at binde til NW'erne med høj antigenicitet til en specifik cellereceptor. Desuden tilføjede biofunktionalisering af NW'erne med antistoffer evnen til at målrette cellerne med receptoren af interesse, CD44 her. Dette blev bekræftet ved konfokal mikroskopi. Selvom biokompatibiliteten af de ubelagte NW'er var høj (>95%), forbedrede tilføjelse af APTES-belægning eller antistoffer til NW'erne deres biokompatibilitet 100%.
Endvidere er belægnings- og biofunktionaliseringsprotokollen effektiv, økonomisk og reproducerbar. Den bør kunne anvendes på ethvert andet nanomateriale af jern-jernoxid, hvorved koncentrationen af både belægningen og de tilknyttede antistoffer bør optimeres på grundlag af nanomaterialets overfladeareal og masse. Denne protokol kan udføres sikkert ved omgivelsesforhold i det generelle laboratorium. Biofunktionaliseringen har forbedret nanomaterialets biokompatibilitet og dets målretningsevne betydeligt. Generelt er NW'erne ekstremt lovende materialer til nanomedicinske anvendelser (herunder multimodale eller kombinatoriske behandlinger, celledetektion eller vejledning og biologisk sensing). Kombineret med biofunktionalisering, som beskrevet her, kan specifik cellemålretning opnås for øget præcision og effektivitet.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af King Abdullah University of Science and Technology (KAUST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-402-7 | |
| 2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES) | Thermscientific | AC172590250 | Concentration 0.1 M and pH 4.7 |
| 3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC) | Thermofisher | PG82079 | |
| 3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES) | Sigma Aldrich | 919302 | |
| 5 mL glass tube | Fisherscientific | 03-339-22C | |
| 96-well plate ( flat bottom) | Sigma Aldrich | CLS3595 | |
| Anti-CD44 antibody | BD Biosciences | 550990 | Clone 515, concentration 1 mg/mL |
| APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99% | Sigma Aldrich | 919-30-2 | Concentration 99% |
| BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit) | Thermofisher | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin solution (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Concentration 35% |
| Cell incubator | Thermofisher | 50116047 | |
| Cell viability reagent | AlamarBlue,Thermofisher | DAL1025 | |
| Colon cancer cells - HCT116 cell line | ATCC | 430641 | |
| Hardwood Hammer | Any hammer tool can be used, there is no specific brand. | ||
| Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS) | Perkin Elmer | ELAN 9000 ICP-MS | The used software is "Elan instrument control session" |
| Laboratory Retort Stand with Clamp | RVFM | 13-0140 | This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath. |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Thermofisher | 12321D | |
| McCoy’s 5A Medium 1x | Gibco | 16600082 | |
| Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer) | Bio-Rad | 1681150 | Microplate Manager 6 software (#168-9520) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Gibco | 14200067 | Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 14190136 | Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium) |
| Plate shaker (Microplate Genie) | Scientific Industries (Genie) | SI-0400 | |
| Single Edge Razor blades | Polysciences | 08410-1 | |
| Sodum hydrixide (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | Concentration 1 M, pH 13 |
| Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS) | Thermofisher | 106627-54-7 | |
| Trypsin | ATCC | 30-2101 | |
| Tube rotator | VWR | 10136-084 | |
| Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-400-204 | |
| Ultrasonic bath (2510) | Branson | 2489502 |
References
- Dürr, S. Magnetic nanoparticles for cancer therapy. Nanotechnology Reviews. 2 (4), 395-409 (2013).
- Espinosa, A. Duality of iron oxide nanoparticles in cancer therapy: amplification of heating efficiency by magnetic hyperthermia and photothermal bimodal treatment. ACS Nano. 10 (2), 2436-2446 (2016).
- Martínez Banderas, A. I., et al. Iron-Based Core-Shell Nanowires for Combinatorial Drug Delivery, Photothermal and Magnetic Therapy. ACS Applied Materials Interfaces. , (2019).
- Das, R. Tunable high aspect ratio iron oxide nanorods for enhanced hyperthermia. The Journal of Physical Chemistry. 120 (18), 10086-10093 (2016).
- Chen, J., et al. Guidance of stem cells to a target destination in vivo by magnetic nanoparticles in a magnetic field. ACS Applied Materials Interfaces. 5 (13), 5976-5985 (2013).
- Juneja, R., Roy, I. Iron oxide-doped niosomes as drug carriers for magnetically targeted drug delivery. International Journal of Nanomedicine. 13, 7 (2018).
- Aires, A., et al. Multifunctionalized iron oxide nanoparticles for selective drug delivery to CD44-positive cancer cells. Nanotechnology. 27 (6), 065103 (2016).
- Trabulo, S., Aires, A., Aicher, A., Heeschen, C., Cortajarena, A. L. Multifunctionalized iron oxide nanoparticles for selective targeting of pancreatic cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta -General Subjects. 1861 (6), 1597-1605 (2017).
- Blanco-Andujar, C., et al. Design of iron oxide-based nanoparticles for MRI and magnetic hyperthermia. Nanomedicine. 11 (14), 1889-1910 (2016).
- Hachani, R., et al. Polyol synthesis, functionalisation, and biocompatibility studies of superparamagnetic iron oxide nanoparticles as potential MRI contrast agents. Nanoscale. 8 (6), 3278-3287 (2016).
- Contreras, M. F., Sougrat, R., Zaher, A., Ravasi, T., Kosel, J. Non-chemotoxic induction of cancer cell death using magnetic nanowires. International Journal of Nanomedicine. 10, 2141 (2015).
- Perez, J. E., et al. Cytotoxicity. , IntechOpen. Ch. 12 (2018).
- Kievit, F. M., Zhang, M. Surface engineering of iron oxide nanoparticles for targeted cancer therapy. Accounts of Chemical Research. 44 (10), 853-862 (2011).
- Xu, H. Antibody conjugated magnetic iron oxide nanoparticles for cancer cell separation in fresh whole blood. Journal of Biomaterials. 32 (36), 9758-9765 (2011).
- Zhang, L., Dong, W. F., Sun, H. B. Multifunctional superparamagnetic iron oxide nanoparticles: design, synthesis and biomedical photonic applications. Nanoscale. 5 (17), 7664-7684 (2013).
- Martínez-Banderas, A. I., et al. Functionalized magnetic nanowires for chemical and magneto-mechanical induction of cancer cell death. Scientific Reports. 6, 35786 (2016).
- Tian, Q., et al. Multifunctional Polypyrrole@ Fe3O4 Nanoparticles for Dual-Modal Imaging and In Vivo Photothermal Cancer Therapy. Small. 10 (6), 1063-1068 (2014).
- Alsharif, N. A., Martiìnez-Banderas, A. I., Merzaban, J., Ravasi, T., Kosel, J. Biofunctionalizing Magnetic Nanowires Toward Targeting and Killing Leukemia Cancer Cells. IEEE Transactions on Magnetics. 2 (99), 1-5 (2018).
- Ventola, C. L. Progress in nanomedicine: approved and investigational nanodrugs. Journal of Pharmacy Therapeutics. 42 (12), 742 (2017).
- Ivanov, Y. P., et al. Tunable magnetic nanowires for biomedical and harsh environment applications. Scientific Reports. 6, 24189 (2016).
- Margineanu, M. B., et al. Semi-automated quantification of living cells with internalized nanostructures. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 4 (2016).
- Jeon, Y. S., et al. Metallic Fe-Au Barcode Nanowires as a Simultaneous T Cell Capturing and Cytokine Sensing Platform for Immunoassay at the Single-Cell Level. ACS Applied Materials Interfaces. 11 (27), 23901-23908 (2019).
- Lee, E., et al. Highly selective CD44-specific gold nanorods for photothermal ablation of tumorigenic subpopulations generated in MCF7 mammospheres. Nanotechnology. 23 (46), 465101 (2012).
- Patel, N. S., Lago-Cachón, D., Mohammed, H., Moreno, J. A., Kosel, J. J. J. Iron Nanowire Fabrication by Nano-Porous Anodized Aluminum and its Characterization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60111 (2019).
- Rozhkova, E. A., et al. Ferromagnetic microdisks as carriers for biomedical applications. Journal of Applied Physics. 105 (7), 306 (2009).
- Kim, D. H., et al. Biofunctionalized magnetic-vortex microdiscs for targeted cancer-cell destruction. Nature Materials. 9 (2), 165-171 (2010).
- Kim, D. H., et al. Mechanoresponsive system based on sub-micron chitosan-functionalized ferromagnetic disks. Journal of Materials Chemistry. 21 (23), 8422-8426 (2011).
- Vitol, E. A., Novosad, V., Rozhkova, E. A. Multifunctional ferromagnetic disks for modulating cell function. IEEE Transactions on Magnetics. 48 (11), 3269-3274 (2012).
- Vitol, E. A., Novosad, V., Rozhkova, E. A. Microfabricated magnetic structures for future medicine: from sensors to cell actuators. Nanomedicine. 7 (10), 1611-1624 (2012).
- Lim, J., et al. Direct isolation and characterization of circulating exosomes from biological samples using magnetic nanowires. Journal of Nanobiotechnology. 17 (1), 1-12 (2019).
- Shore, D., et al. Electrodeposited Fe and Fe–Au nanowires as MRI contrast agents. Chemical Communications. 52 (85), 12634-12637 (2016).
- Martínez-Banderas, A. I., et al. Iron-Based Core-Shell Nanowires for Combinatorial Drug Delivery and Photothermal and Magnetic Therapy. ACS Applied Materials Interfaces. 11 (47), 43976-43988 (2019).
- Martínez-Banderas, A. I., et al. Magnetic core-shell nanowires as MRI contrast agents for cell tracking. Journal of Nanobiotechnology. 18 (1), 1-12 (2020).
- Zhu, L., Zhou, Z., Mao, H., Yang, L. Magnetic nanoparticles for precision oncology: theranostic magnetic iron oxide nanoparticles for image-guided and targeted cancer therapy. Nanomedicine. 12 (1), 73-87 (2017).
- Guleria, A., Priyatharchini, K., Kumar, D. Applications of Nanomaterials. , Elsevier. 345-389 (2018).
- Allara, D. L., Nuzzo, R. G. Spontaneously organized molecular assemblies. 2. Quantitative infrared spectroscopic determination of equilibrium structures of solution-adsorbed n-alkanoic acids on an oxidized aluminum surface. Langmuir. 1 (1), 52-66 (1985).
- Allara, D. L., Nuzzo, R. G. Spontaneously organized molecular assemblies. 1. Formation, dynamics, and physical properties of n-alkanoic acids adsorbed from solution on an oxidized aluminum surface. Langmuir. 1 (1), 45-52 (1985).
- Schrittwieser, S., Reichinger, D., Schotter, J. Applications, surface modification and functionalization of nickel nanorods. Materials and Structures. 11 (1), 45 (2018).
- Lim, J., Choi, M., Lee, H., Kim, Y. H., Han, J. Y., Lee, E. S., Cho, Y. Direct isolation and characterization of circulating exosomes from biological samples using magnetic nanowires. Journal of Nanobiotechnology. 17 (1), 1 (2019).
- Nemati, Z., et al. Magnetic Isolation of Cancer-derived Exosomes Using Fe/Au Magnetic Nanowires. ACS Applied Nano Materials. 3 (2), 2058-2069 (2020).
- Hainfeld, J. F., Liu, W., Halsey, C. M., Freimuth, P., Powell, R. D. Ni-NTA-gold clusters target His-tagged proteins. Journal of Structural Biology. 127 (2), 185-198 (1999).
- Agarwal, G., Naik, R. R., Stone, M. O. Immobilization of histidine-tagged proteins on nickel by electrochemical dip pen nanolithography. Journal of the American Chemical Society. 125 (24), 7408-7412 (2003).
- Aswal, D., Lenfant, S., Guerin, D., Yakhmi, J., Vuillaume, D. Self assembled monolayers on silicon for molecular electronics. Analytica Chimica Acta. 568 (1-2), 84-108 (2006).
- Haensch, C., Hoeppener, S., Schubert, U. S. Chemical modification of self-assembled silane based monolayers by surface reactions. Chemical Society Reviews. 39 (6), 2323-2334 (2010).
- Wildt, B., Mali, P., Searson, P. C. Electrochemical template synthesis of multisegment nanowires: Fabrication and protein functionalization. Langmuir. 22 (25), 10528-10534 (2006).
- Schladt, T. D., Schneider, K., Schild, H., Tremel, W. Synthesis and bio-functionalization of magnetic nanoparticles for medical diagnosis and treatment. Dalton Transactions. 40 (24), 6315-6343 (2011).
- Kumar, C. S. Magnetic nanomaterials. , John Wiley & Sons. (2009).
- Peiris, P., et al. Precise targeting of cancer metastasis using multi-ligand nanoparticles incorporating four different ligands. Nanoscale. 10 (15), 6861-6871 (2018).
- Veiseh, O., Gunn, J. W., Zhang, M. Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging. Journal of Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (3), 284-304 (2010).
- Rosenblum, D., Joshi, N., Tao, W., Karp, J. M., Peer, D. Progress and challenges towards targeted delivery of cancer therapeutics. Nature Communications. 9 (1), 1410 (2018).
- Bazak, R., Houri, M., El Achy, S., Kamel, S., Refaat, T. Cancer active targeting by nanoparticles: a comprehensive review of literature. Journal of Cancer Research Clinical Oncology. 141 (5), 769-784 (2015).
- Zeilstra, J., et al. CD44 expression in intestinal epithelium and colorectal cancer is independent of p53 status. PLoS One. 8 (8), 72849 (2013).
- Pesarrodona, M., et al. Intracellular targeting of CD44+ cells with self-assembling, protein only nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics. 473 (1-2), 286-295 (2014).
- Chandra, V., et al. Quantitative assessment of CD44 genetic variants and cancer susceptibility in Asians: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (45), 74286 (2016).
- Thapa, R., Wilson, G. D. The importance of CD44 as a stem cell biomarker and therapeutic target in cancer. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Gao, S., Zheng, X., Jiao, B., Wang, L.
- Das, M., Mohanty, C., Sahoo, S. K. Ligand-based targeted therapy for cancer tissue. Expert Opinion on Drug Delivery. 6 (3), 285-304 (2009).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: the Immune System in Health and Disease. 2, Garland Pub. New York. (2001).
- Patel, N. S., Lago-Cachón, D., Mohammed, H., Moreno, J. A., Kosel, J. Iron Nanowire Fabrication by Nano-Porous Anodized Aluminum and its Characterization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60111 (2019).
- Rao, X., et al. High density gold nanoparticles immobilized on surface via plasma deposited APTES film for decomposing organic compounds in microchannels. Applied Surface Science. 439, 272-281 (2018).
- Merck. (3-Aminopropyl)triethoxysilane. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440140?lang=en®ion=SA (2020).
- Munguía-Cortés, L., et al. APTES-functionalization of SBA-15 using ethanol or toluene: Textural characterization and sorption performance of carbon dioxide. Journal of the Mexican Chemical Soceity. 61 (4), 273-281 (2017).
- Sperling, R. A., Parak, W. J. Surface modification, functionalization and bioconjugation of colloidal inorganic nanoparticles. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical & Physical Engineering Sciences. 368 (1915), 1333-1383 (2010).
