Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מדידת ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין ובהתכווצות בשרירי שלד בוגרים מבודדים ומדגרים מעכברים

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/61398
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen

Summary

ויסות שלם של ספיגת גלוקוז בשרירים חשוב לשמירה על הומאוסטזיס של גלוקוז בכל הגוף. פרוטוקול זה מציג הערכה של ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין ובהתכווצות בשרירי שלד בוגרים מבודדים ודגירה כאשר הם מתארים את ההשפעה של התערבויות פיזיולוגיות שונות על חילוף החומרים של גלוקוז בכל הגוף.

Abstract

שרירי השלד הם רקמה המגיבה לאינסולין ובדרך כלל תופסים את רוב הגלוקוז שנכנס לדם לאחר הארוחה. יתר על כן, דווח כי שרירי השלד עשויים להגביר את מיצוי הגלוקוז מהדם עד פי 50 במהלך פעילות גופנית בהשוואה לתנאי מנוחה. העלייה בספיגת הגלוקוז בשרירים במהלך פעילות גופנית וגירוי אינסולין תלויה בטרנסלוקציה של טרנספורטר גלוקוז 4 (GLUT4) מתאים תוך תאיים לקרום פני השטח של תאי השריר, כמו גם זרחון של גלוקוז לגלוקוז-6-פוספט על ידי הקסוקינאז II. בידוד ודגירה של שרירי עכבר כגון m. soleus ו- m. extensor digitorum longus (EDL) הוא מודל ex vivo מתאים לחקר ההשפעות של אינסולין והתכווצות חשמלית המושרה (מודל לפעילות גופנית) על ספיגת גלוקוז בשרירי השלד הבוגרים. לפיכך, מודל ה- ex vivo מאפשר הערכה של רגישות לאינסולין בשרירים ומאפשר להתאים את ייצור כוח השריר במהלך ההתכווצות ומבטיח גיוס אחיד של סיבי שריר במהלך מדידות של ספיגת גלוקוז בשרירים. יתר על כן, המודל המתואר מתאים לבדיקת תרכובות פרמקולוגיות שעשויות להשפיע על הרגישות לאינסולין בשרירים או עשויות להועיל כאשר מנסים להגדיר את המורכבות הרגולטורית של ספיגת גלוקוז בשריר השלד.

כאן אנו מתארים ומספקים פרוטוקול מפורט כיצד למדוד ספיגת גלוקוז מגורה של אינסולין והתכווצות בסולאוס מבודד ודגירה ותכשירי שרירי EDL מעכברים באמצעות רדיו-תווית [3H]2-deoxy-D-glucose ו-[14C] מניטול כסמן חוץ-תאי. זה מאפשר הערכה מדויקת של ספיגת גלוקוז בשרירי השלד הבוגרים בהיעדר גורמים מבלבלים שעלולים להפריע למודל החייתי השלם. בנוסף, אנו מספקים מידע על הכדאיות המטבולית של שרירי שלד עכברים מדוגרים, מה שמרמז על כך שהשיטה המיושמת כוללת כמה אזהרות בתנאים מסוימים בעת לימוד חילוף החומרים של אנרגיית השרירים.

Introduction

שרירי השלד הם בעלי יכולת לחלץ כמויות גדולות של גלוקוז מהחלל החוץ-תאי בתגובה לאינסולין ולפעילות גופנית. זה עוזר לשמור על הומאוסטזיס של גלוקוז בכל הגוף ומבטיח אספקת גלוקוז בזמנים של ביקוש גבוה לאנרגיה. מאחר שהוכח כי ויסות שלם של ספיגת הגלוקוז בשרירי השלד חשוב לבריאות הכללית ולביצועים הגופניים 1,2, מדידות של ספיגת גלוקוז בשרירים במהלך מצבים שונים זכו לתשומת לב רבה. בבני אדם ובבעלי חיים, המהדק ההיפר-אינסולינמי-אוגליקמי שימש כטכניקת תקן הזהב להערכת הרגישות לאינסולין in vivo 3,4. בניגוד לממצאים שהתקבלו מבדיקת סבילות לגלוקוז דרך הפה, טכניקת המהדק ההיפר-אינסולינמי-יוגליקמי אינה דורשת תפקוד שלם של מערכת העיכול או הפרשת אינסולין מהלבלב ובכך מאפשרת להשוות את תגובות האינסולין בין נבדקים המפגינים שינויים בתפקוד מערכת העיכול ו/או הלבלב. מדידות של ספיגת גלוקוז בשרירים in vivo במהלך פעילות גופנית בבני אדם בוצעו לעתים קרובות מאז שנות ה-60של המאה ה-20 5. תחילה על ידי שימוש בטכניקות איזון עורקים6 ומאוחר יותר על ידי שימוש בהדמיית טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) בשילוב עם אנלוגי פולט גלוקוז פולט פוזיטרון, למשל 18F-Fluoro-deoxy-glucose7. במכרסמים, ספיגת גלוקוז בשריר מגורה פעילות גופנית in vivo מבוצעת בדרך כלל על ידי שימוש באנלוגי גלוקוז רדיואקטיביים או יציבים המסומנים באיזוטופים 8,9,10.

שיטה משלימה למדידות של ספיגת גלוקוז בשרירים in vivo, היא לבודד ולדגום שרירים קטנים ממכרסמים ולאחר מכן למדוד את ספיגת הגלוקוז באמצעות אנלוגים רדיואקטיביים או יציבים בעלי תווית איזוטופית של גלוקוז 11,12,13. שיטה זו מאפשרת כימות מדויק ואמין של שיעורי ספיגת הגלוקוז בשרירי השלד הבוגרים וניתן לבצע אותה בנוכחות ריכוזי אינסולין שונים ובמהלך ההתכווצות המתעוררת על ידי גירוי חשמלי. חשוב מכך, מדידות של ספיגת גלוקוז בשרירי שלד מבודדים ודגירה הן רלוונטיות כאשר חוקרים את הפנוטיפ המטבולי של השריר של עכברים שעברו התערבויות שונות (למשל תזונה, פעילות גופנית, זיהום, טיפולים). מודל שרירי השלד המבודדים הוא גם כלי מתאים לבדיקת תרכובות פרמקולוגיות שעשויות להשפיע על ספיגת הגלוקוז כשלעצמה ו/או לשנות את הרגישות לאינסולין 12,14. בדרך זו, ניתן לבחון ולהעריך את היעילות של תרכובות שנועדו לווסת את חילוף החומרים של הגלוקוז בשרירים בסביבה מבוקרת מאוד לפני ניסויי in vivo הבאים במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים.

בתנאים מסוימים, כדאיות מטבולית עשויה להוות אתגר במערכת מודל שרירי השלד המבודדת והדגירה. ואכן, היעדר מערכת הדם בשרירים המדגרים כרוך בכך שאספקת מצעים (למשל חמצן וחומרים מזינים) תלויה באופן מלא בדיפוזיה פשוטה בין סיבי השריר לסביבה. בהקשר זה, יש חשיבות לכך שהשרירים הדגירה הם קטנים ודקים ולכן, מהווים פחות מחסום לפיזור חמצן במהלך הדגירה15. במיוחד במהלך דגירה ממושכת במשך מספר שעות, מצבים היפוקסיים עלולים להתפתח עקב אספקת חמצן לא מספקת וכתוצאה מכך דלדול אנרגיית השרירים15. למרות שסמנים שונים של כדאיות מטבולית בשרירי חולדה דגירה דווחו בעבר לצד זיהוי משתנים חשובים המסייעים בשמירה על כדאיות שרירי החולדה15, הערכה מקיפה של הכדאיות המטבולית בשרירי עכברים דגירה קטנים עדיין מוצדקת. לפיכך, כיום, תכולת הגליקוגן שימשה בעיקר כסמן של כדאיות מטבולית בשרירי שלד עכבר דגירה16,17.

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט למדידת ספיגת גלוקוז מגורה בזאלי, אינסולין והתכווצות בסולאוס מבודד ומדגר ושרירי EDL מעכברים באמצעות סימון רדיו-תאי [3H]2-דאוקסי-D-גלוקוז ומניטול [14C] כסמן חוץ-תאי. במחקר הנוכחי, ספיגת הגלוקוז נמדדה בפרק זמן של 10 דקות והשיטה מוצגת עם שימוש בריכוזי אינסולין תת-מקסימליים ויעילים ביותר, כמו גם פרוטוקול התכווצות יחיד. עם זאת, ניתן לשנות בקלות את הפרוטוקולים המתוארים כאן ביחס לזמן הדגירה, מינון האינסולין ופרוטוקול הגירוי החשמלי. יתר על כן, אנו מספקים אפיון יסודי של סמנים שונים של כדאיות מטבולית בסולאוס דגירה ושריר עכבר EDL. התוצאות מצביעות על כך שתוספת גלוקוז למאגר הדגירה חיונית כדי לשמור על הכדאיות המטבולית של השריר המדגר במשך שעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הליכים הכוללים חיות מחקר צריכים להתבצע בהתאם להנחיות הרלוונטיות ולחקיקה המקומית. כל הניסויים בבעלי חיים ששימשו למחקר זה עמדו באמנה האירופית להגנה על בעלי חוליות המשמשים למטרות ניסוייות ומדעיות אחרות ואושרו על ידי הפיקוח הדני על ניסויים בבעלי חיים.

1. הכנת המנגנון הניסיוני ולולאות התפרים

הערה: לצורך מחקר זה, השתמש במערכת מיוגרפיה משולבת של רצועות שרירים עם ווים מותאמים אישית לדגירה של שרירי שלד עכברים מבודדים (איור 1). מערכת זו מאפשרת לשרירים להתרחץ בתמיסה פיזיולוגית עם חמצון מתמשך (95% O2 ו-5% CO2) ובטמפרטורה קבועה. אמבט רקמת השריר מוצמד למתמר כוח למדידת ייצור כוח השריר במהלך כיווץ. כדי לעורר ולתעד תגובות מיו-מכניות במהלך כיווץ, השתמש בממריץ דופק חשמלי ובתוכנית איסוף נתונים, בהתאמה. לעורר את השרירים המדוגרים להתכווץ על ידי אלקטרודות פלטינה הממוקמות במרכז ובשני צידי השריר.

  1. הפעל את מערכת המיוגרף ואת התאים החמים עד 30 °C (84 °F). פתח תוכנת איסוף נתונים התואמת למערכת המיוגרפיה וכייל מתמרים כוח כדי להבטיח יכולת השוואה בין מערכי נתונים.
  2. התחילו בחיתוך של כ-16 ס"מ גדילים של תפר ניילון כירורגי שאינו נספג. השתמש במלקחיים כדי ליצור לולאה בקוטר של כ-0.4 ס"מ מגדיל יחיד. חזור על כך עד שייווצרו מספיק לולאות. כל שריר זקוק לשתי לולאות - אחת לפרוקסימלית ואחת לגיד הדיסטלי.

2. הכנת פתרונות ומדיית דגירה

  1. הכנת מדיית דגירה בסיסית
    1. הכינו את תמיסות המלאי הבאות: 2.5 M נתרן כלורי (NaCl, 250 מ"ל), 0.5 M נתרן ביקרבונט (NaHCO3, 250 מ"ל), 0.5 M אשלגן כלורי (KCl, 50 מ"ל), 0.25 M סידן כלורי (CaCl2, 50 מ"ל), 0.25 M אשלגן דיהידרוגן פוספט (KH2PO4, 50 מ"ל), 0.25 M מגנזיום סולפט (MgSO4, 50 מ"ל), 110 mM נתרן פירובט (Na-Pyruvate, 100 מ"ל), 500 מ"מ D-מניטול (100 מ"ל), 1 M 2-דאוקסי-D-גלוקוז (4 מ"ל), תמיסה של 15% של אלבומין בסרום בקר (BSA) דיאליזציה נגד כרית קרבס-רינגר-הנסלייט (KRH) (המתוארת להלן בשלב 4) (100 מ"ל).
      הערה: נדרשים שני פתרונות למדידת ספיגת גלוקוז במנוחה ובהתכווצות. יתר על כן, כל ריכוז אינסולין יחיד המשמש להערכת ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין דורש שתי תמיסות. לפיכך, בסך הכל יש צורך בשש תמיסות שונות למדידת ספיגת גלוקוז בזלתית, תת-מקסימלית, אינסולין תת-מקסימלי, ספיגת גלוקוז מגורה התכווצות בשרירי שלד עכברים מבודדים. בהמשך, 'מדיית הדגירה הבסיסית' מתייחסת למדיה ללא אינסולין או מעקבים רדיואקטיביים. 'מדיית הדגירה' מתייחסת למדיה המכילה אינסולין. 'מדיה לדגירה של ספיגת גלוקוז' מתייחסת למדיה המכילה 2-דאוקסי-D-גלוקוז ומעקבים רדיואקטיביים בנוסף לאינסולין בריכוז זהה לזה המשמש ב'מדיית הדגירה'.
    2. הכן חיץ KRH על ידי השלמת מים אולטרה-אפורים (ddH2O) עם NaCl (117 mM), NaHCO3 (24.6 mM), KCl (4.7 mM), CaCl2 (2.5 mM), KH2PO4 (1.2 mM) ו- MgSO4 (1.2 mM). לאחר מכן, גז את המאגר KRH עם 95% O2 ו 5% CO2 במשך 10 דקות לפחות. ה- pH הרצוי של מאגר ה- KRH צריך להיות בין 7.35-7.45 ב- 30 °C (84 °F). אם מתבצעת התאמת pH בטמפרטורת החדר, ה- pH של מאגר ה- KRH צריך להיות בין 7.25-7.35.
    3. הוסיפו את BSA (0.1%), Na-Pyruvate (2 mM) ו-D-mannitol (8 mM) לחיץ ה-KRH המותאם לגזים ומתואמים ל-pH כדי להשלים את מדיית הדגירה הבסיסית. אחסן את מדיית הדגירה הבסיסית במיכל אטום כדי למזער את הדה-גזיפיקציה של O2 ו- CO2 והניח מדיה ב-30 מעלות צלזיוס.
      הערה: בדרך כלל, האוסמולריות של תוספי ה-KRH (כלומר Na-Pyruvate, D-Mannitol ו-D-glucose) נשמרת קבועה לאורך כל הניסוי כדי למנוע התכווצות או התרחבות של תאי השריר. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש באוסמולריות של 10 mM עבור תוספי ה- KRH. אם יש צורך במאגר המכיל גלוקוז, החליפו את תוספי ה-KRH כדי להתאים לצרכים, למשל 5 mM D-גלוקוז ו-5 mM D-mannitol.
    4. כדי להימנע ממזהמים אפשריים הקשורים ל-BSA במאגר הדגירה, דיאליזה BSA נגד KRH.
      1. כדי להפוך פתרון מניות BSA של 15% לחיוג מול מאגר KRH, התחל על ידי המסת 300 גרם של BSA ללא שומן בדרגה אנליטית ב-900 מ"ל של מאגר KRH. לאחר מכן, מרתיחים את צינור הדיאליזה במים אדומים עד שהצינורות רכים.
      2. מלאו את הצינורות בתמיסת BSA-KRH ואבטחו את קצוות הצינורות. הניחו את הצינורות עם BSA-KRH ב-5 ליטר של חיץ KRH והשאירו אותו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. למחרת החליפו את חיץ ה-KRH והשאירו את הצינורות עם BSA-KRH ב-KRH buffer למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
      3. לבסוף, אסוף את תמיסת BSA-KRH מהצינורות והוסף את מאגר KRH לנפח סופי של 2 ליטר (כלומר, 15% פתרון מניות BSA-KRH). חלקו את תמיסת המלאי BSA-KRH של 15% ל-aliquots ואחסנו במקפיא בטמפרטורה של כ-20 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת מדיית דגירה המכילה אינסולין
    1. עבור מדיית הדגירה המכילה ריכוז אינסולין יעיל באופן תת-מקסימלי, יש להוסיף 1 μL של תמיסת מלאי אינסולין של 100 mU/mL לכל מ"ל של מדיית הדגירה הבסיסית (100 μU/mL אינסולין).
    2. עבור מדיית הדגירה המכילה ריכוז אינסולין יעיל ביותר, הוסיפו 1 μL של תמיסת מלאי אינסולין של 10 U/mL לכל מ"ל של מדיית דגירה בסיסית (10 mU/mL אינסולין).
  3. הכנת מדיית הדגירה של ספיגת הגלוקוז
    אזהרה: טיפול בחומר רדיואקטיבי מותר רק באזור מוגבל ומבוקר על ידי כוח אדם מורשה וכמה אוניברסיטאות, מוסדות מחקר וחברות עשויים לדרוש רכישת "היתר שימוש ברדיואקטיביות". יש לטפל בחומרים ובפסולת על פי נהלים, הנחיות וחקיקה מקומיים מתאימים.
    1. בצע את אותו הליך כמתואר בסעיף 2.1.2.
    2. הוסיפו BSA (0.1%), Na-Pyruvate (2 mM), D-מניטול (7 mM) ו-2-deoxy-D-גלוקוז (1 mM) למאגר KRH המותאם לגזים ול-pH.
    3. הוסף [3H]2-deoxy-D-גלוקוז (0.028 MBq/mL) ו-[14C]מניטול (0.0083 MBq/mL) למאגר KRH המוסף כדי להשלים את מדיית הדגירה של ספיגת הסוכר. יש לאחסן בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. אם [3H]2-דאוקסי-D-גלוקוז ו-[14C]מניטול מומסים באתנול יש להסיר את האתנול על ידי אידוי מתווך N2 לפני השימוש.
    4. עבור אמצעי הדגירה של ספיגת הגלוקוז המכילה ריכוז אינסולין יעיל באופן תת-מקסימלי, הוסיפו 1 μL של תמיסת מלאי אינסולין של 100 mU/mL לכל מ"ל של מדיית דגירה של ספיגת גלוקוז (100 μU/mL אינסולין).
    5. עבור מדיית הדגירה לספיגת גלוקוז המכילה ריכוז אינסולין יעיל ביותר, יש להוסיף 1 μL של תמיסת מלאי אינסולין של 10 U/mL לכל מ"ל של מדיית הדגירה לספיגת גלוקוז (10 mU/mL אינסולין).

3. בעלי חיים וכריתת סולאוס עכבר ושריר EDL לדגירה

הערה: יש לבצע הליכים הכוללים חיות מחקר בהתאם להנחיות הרלוונטיות ולחקיקה המקומית. ניתן להשתמש בהליך המתואר עם עכברים זכרים ונקבות מגודלים או זמינים מסחרית של זנים שונים ורקעים גנטיים שונים. ההליך הבא מסופק עבור נקבת עכברי C57Bl/6J המוזנים. בממוצע, העכברים היו בני 19 שבועות ומשקלם 25 גרם. העכברים נשמרו על מחזור בהיר-כהה של 12:12 שעות עם גישה חופשית לצ'או ולמים של מכרסמים סטנדרטיים. ניסויים בבעלי חיים החלו בסביבות השעה 9:00 בבוקר שעון מקומי וכל בעלי החיים הוקרבו תוך פרק זמן של שעתיים.

  1. הוסיפו 4 מ"ל של מדיית דגירה בסיסית שחוממה מראש (30 מעלות צלזיוס) לכל תא דגירה וודאו שמדיית הדגירה הבסיסית מחומצנת באופן רציף עם 95% O2 ו-5% CO2.
  2. הרדמה עכברים בזריקה תוך-צפקית של פנטוברביטל (משקל גוף של 10 מ"ג/100 גרם) או הרדמה זמינה אחרת (למשל טריברומואתנול).
    הערה: שים לב שבמדינות מסוימות ייתכן שיהיה צורך ברישיון לטיפול בפנטוברביטל ובתרופות הרדמה אחרות. לפני שניתן ליזום כריתת שרירים, הרדמה של כל בעל חיים חייבת להיות מושרית כראוי. כדי להבטיח זאת, נבדקים רפלקסים של זנב ורגליים. לקבלת תוצאות אופטימליות יש לתרגל את הניתוח היטב כדי למנוע פגיעה בשרירים במהלך ההסרה.
  3. מניחים עכברים מורדמים הנוטים למגש דיסקציה (למשל מכסה קלקר) ומצמידים את כפותיהם הקדמיות והאחוריות, לפי הצורך, באמצעות מחט.
  4. הסירו את העור מהרגל התחתונה וודאו שגם גיד אכילס וגם מפרק הברך נראים לעין.
    1. עבור ניתוח של שריר סולאוס, התחל על ידי הצמדת לולאת תפר אחת לגיד אכילס. הצמידו את מלקחי הפין לגיד אכילס באופן דיסטלי של לולאת התפר וחתכו כדי לשחרר את שרירי הסולאוס והגסטרוקנמיוס מהכף. החליקו בזהירות את מלקחי הפין על פני העכבר ובכך חשפו את שריר הסולאוס.
    2. הצמידו את מלקחי הפין והניחו לולאת תפר שנייה סביב הגיד הפרוקסימלי של שריר הסולאוס. לאחר מכן, חותכים את הגיד הפרוקסימלי ומנתחים את סולאוס (כולל שתי לולאות התפר המחוברות) ללא שרירי גסטרוקנמיוס. מקם במהירות את שריר הסולאוס בתא הדגירה על ידי הצמדת כל לולאת תפר לקרסים המתאימים.
  5. הסר את החיתולית המכסה את m. tibialis הקדמי (TA) באמצעות מלקחיים. אם נעשה נכון, גידים דיסטליים של שרירי TA ו- EDL צריכים להיות לבנים ברורים וגלויים; ומופרדים זה מזה.
  6. חותכים את הגיד הדיסטלי של שריר ה-TA ומנתחים את השריר לצורך ניתוחים מאוחרים יותר (למשל גנוטיפ). באמצעות מלקחיים, שחררו בעדינות את שריר ה-EDL מהרקמות הסובבות אותו אך השאירו את השריר שלם ואל תחתכו את הגידים. מניחים לולאת תפר אחת סביב הגיד הדיסטלי ואת לולאת התפר השנייה סביב הגיד הפרוקסימלי של EDL.
  7. לאחר מכן, חותכים את הגידים ומשחררים את שריר ה-EDL עם שתי לולאות תפר מחוברות ומניחים במהירות את השריר בתא הדגירה על ידי חיבור כל לולאת תפר לווים המתאימים. על מנת לא לאבד מתח במהלך הדגירה ובמיוחד במהלך התכווצות חשמלית של שרירי הסולאוס וה- EDL, יש חשיבות רבה לתקן את לולאות התפר סביב הגידים עם קשרים הדוקים.
  8. לבסוף, להרדים את החיה על ידי למשל נקע צוואר הרחם.
  9. לאחר שהשרירים נותחו והוכנסו לתאי דגירה, התאימו את מתח המנוחה של כל שריר לכ-5 mN והדגירו את השרירים למשך 10 דקות לפחות לפני תחילת פרוטוקול הניסוי.

4. ספיגת גלוקוז מגורה אינסולין בשרירי שלד עכברים מבודדים

  1. לאחר שלב 3.9 החליפו את מדיית הדגירה הבסיסית במדיית הדגירה המכילה אינסולין ללא אינסולין (אמצעי דגירה בסיסית), ריכוז אינסולין יעיל תת-מקסימלית או ריכוז אינסולין יעיל ביותר והשאירו בתאי הדגירה למשך 20 דקות. מרווחים כל תא דגירה בדקה אחת, ובכך מפנים זמן לקציר השרירים הבא.
  2. בסוף תקופת הגירוי של 20 דקות, החליפו את אמצעי הדגירה במדיית הדגירה של ספיגת הגלוקוז המכילה ריכוז זהה של אינסולין והשאירו בתאי הדגירה למשך 10 דקות, שוב עם מרווח של דקה אחת בין כל תא דגירה.
  3. לאחר 10 דקות של דגירה במדיית הדגירה של ספיגת הגלוקוז, הסירו בעדינות את השרירים מתאי הדגירה ושטפו אותם במדיית דגירה בסיסית קרה כקרח. לאחר מכן, ייבשו במהירות את השרירים על נייר מסנן לפני הסרת לולאות התפירה והשרירים מוקפאים בחנקן נוזלי. זה הכרחי כי השרירים דגירה נקטפים במהירות אם רוצים גם לחקור מטבוליטים תוך תאיים שונים ואיתות חלבונים בנוסף לספיגת גלוקוז.
  4. אספו 100 μL של מדיית הדגירה של ספיגת הגלוקוז מכל תא דגירה ואחסנו אותה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. כמות הרדיואקטיביות בדגימות אלה תיכלל בחישוב ספיגת הגלוקוז בשרירים.

5. ספיגת גלוקוז מגורה התכווצות בשרירי שלד עכבר מבודדים

הערה: כדי לגרום להתכווצות של שרירי שלד עכברים מבודדים השתמש בפרוטוקול הבא: 1 רכבת / 15 שניות, כל רכבת באורך 1 שניות המורכבת מפולסים של 0.2 אלפיות השנייה המועברים ב - 100 הרץ. עם זאת, סביר להניח שגם פרוטוקולים דומים אחרים שמעוררים התכווצות של שרירי שלד של עכברים מבודדים יעבדו. חשוב לציין, יש להתאים את המתח כדי ליצור פיתוח כוח מקסימלי של השריר המדגר, התלוי במערך הניסוי. אם זה לא מובטח, אתה עלול להסתכן בכך שלא כל סיבי השריר מתכווצים. בתורו, זה עלול לגרום להטיה במערך הנתונים.

  1. לאחר שלב 3.9 מניחים את אלקטרודות הפלטינה במרכז ובשני צידי השרירים. ליזום התכווצות השרירים מיד לאחר החלפת מדיית הדגירה הבסיסית במדיית הדגירה של ספיגת הגלוקוז. במידת האפשר, מרווחים כל תא דגירה בדקה אחת, ובכך מפנים זמן לקציר השרירים הבא. זכור להקליט ייצור כוח מכל שריר דגירה.
  2. לאחר 10 דקות של התכווצות במדיית הדגירה של ספיגת הגלוקוז, הסירו את אלקטרודות הפלטינה, אספו בעדינות את השרירים מתאי הדגירה ושטפו אותם במדיית דגירה בסיסית קרה כקרח. לאחר מכן, ייבש במהירות את השרירים על נייר מסנן לפני שלולאות התפר מוסרות והשרירים קפואים בחנקן נוזלי. יש לבצע את כל הליך קצירת השרירים מהר ככל האפשר.
  3. אספו 100 μL של מדיית הדגירה של ספיגת הגלוקוז מכל תא דגירה ואחסנו אותה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. כמות הרדיואקטיביות בדגימות אלה תיכלל בחישוב ספיגת הגלוקוז בשרירים.

6. הומוגניזציה ועיבוד של שרירי השלד

הערה: ההליך שניתן להלן להומוגניזציה של השריר מאפשר לקבוע הן את ספיגת הגלוקוז והן את האיתות המיוצלולרי על ידי כתם מערבי באותה קבוצה של דגימות שרירים.

  1. הומוגניזציה של כל שריר ב-400 μL של חיץ קר כקרח עם pH 7.5 המכיל 10% גליצרול, 20 mM נתרן-פירופוספט, 1% IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM פניל-מתיל-סולפונילפונילפלואוריד (מומס באיזופרופנול), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-גליצרופוספט, 10 mM נתרן פלואוריד (NaF), 1 mM חומצה אתילנדיאמינט-אצטית (EDTA), 1 mM גליקולתרדיאמין חומצה טראומטית (EGTA), 10 מיקרוגרם/מ"ל אפרוטינין, 10 מיקרוגרם/מ"ל לאופפטין, 3 mM בנזמידין ו-2mM נתרן-אורתובנדט באמצעות חרוזי פלדה ורקמות (2 x 45 שניות ב-30 הרץ). סובב את כל ההומוגנאטים מקצה לקצה במשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הם עוברים צנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. אספו את הליזאט (סופרנטנט) המשמש לקביעת ספיגת הגלוקוז בשרירים.

7. קביעת 2-דאוקסיגלוקז ומניטול בעלי תווית רדיו

  1. הוסיפו 150 μL של כל שריר lysate ו-25 μL של מדיית הדגירה של ספיגת הגלוקוז מכל תא דגירה כדי להפריד בקבוקונים של ספירת חרציות נוזלית המכילים 2 מ"ל של נוזל ספיגת סוכר. יתר על כן, להכין שני בקבוקוני בקרה עיוורים המכילים רק 3 מ"ל של נוזל scintillation נוזלי. סגרו את כל הבקבוקונים וערבבו היטב על ידי מערבולת כל בקבוקון במשך כ-5 שניות.
  2. ממקמים את הבקבוקונים במונה נצנוץ נוזלי ומודדים רדיואקטיביות של [3H]2-דאוקסי-D-גלוקוז ומניטול [14C] בהתאם להנחיות היצרן. הקלט DPM (התפוררות לדקה) עבור כל בקבוקון נצנוץ נוזלי.

8. חישוב שיעורי ספיגת הגלוקוז בשרירים

  1. השתמשו בליזאט משלב 6.1 כדי למדוד את ריכוז החלבון הכולל בכל דגימת שריר באמצעות שיטות סטנדרטיות לכימות חלבונים (למשל, מבחני חומצה ביצ'ינצ'ונינית או ברדפורד). חשב את כמות החלבון (מ"ג) שנוספו לכל בקבוקון חרטום.
    הערה: קצב ספיגת הגלוקוז עבור כל דגימת שריר מחושב על-ידי הפחתת הכמות של [3H]2-deoxy-D-glucose הממוקמת בחלל החוץ-תאי מהכמות הכוללת של [3H]2-deoxy-D-glucose בדגימת השריר באמצעות [14C]mannitol כסמן חוץ-תאי. ההנחה היא כי [3H]2-deoxy-D-גלוקוז ו-[14C]mannitol מציגים תכונות דיפוזיה דומות בתוך רקמת השריר במהלך הדגירה. בצע את החישובים הבאים:
  2. התחל על ידי הפחתת [3H] ו- [14C] DPM של דגימות הבקרה העיוורות מכל דגימות השרירים והמדיה.
  3. קבע את המרחב החוץ-תאי של השריר ב-μL (μL-ECS):
    [14ג] שריר DPM / ([14C]DPMמדיה / Mvol)
  4. חישוב הכמות של [3H]DPM במרחב החוץ-תאי של השריר ([3H]DPMECS):
    μL-ECS × ([3H]DPMמדיה / Mvol)
  5. חשב את הכמות של [3H]DPM במרחב התוך-תאי של השריר ([3H]DPMICS):
    [3ח] שריר DPM− [3H]DPMECS
  6. חשב את קצב ספיגת הגלוקוז בשרירים (μmol / g חלבון / שעה):
    [3ח] DPMICS / ([3H]DPMמדיה / Mvol) / [2-deoxy-D-גלוקוז])) / חלבון mg) / Th
    הערה: עבור כל המשוואות לעיל,
    [14ג] שריר DPM הוא כמות הרדיואקטיביות של מניטול [14C] בדגימת שריר;
    [14ג] מדיית DPM היא כמות הרדיואקטיביות של מניטול [14C] במדגם מדיה;
    [3ח] שריר DPM הוא הכמות של [3H]2-deoxy-D-גלוקוז רדיואקטיביות בדגימת שריר;
    [3ח] מדייתDPM היא כמות הרדיואקטיביות של [3H]2-deoxy-D-glucose במדגם מדיה;
    [3ח] DPMECS היא כמות הרדיואקטיביות של [3H]2-deoxy-D-גלוקוז במרחב החוץ-תאי של השריר;
    [3ח] DPMICS היא כמות הרדיואקטיביות של [3H]2-deoxy-D-glucose בחלל התוך-תאי של השריר;
    μL-ECS הוא המרחב החוץ-תאי של השריר ב-μL;
    Mvol הוא הנפח (μL) של מדיית הדגירה המשמשת לספירת חרציות (למשל '25' כאמור לעיל);
    Th הוא גורם הזמן המשמש לחישוב שיעורי ספיגה לשעה (כלומר, '1/6' בעת דגירה של שרירים עם מדיית ספיגת גלוקוז למשך 10 דקות)
  7. קחו בחשבון את החישוב לדוגמה זה. [3H] ו-[14C] DPM של דגימות הבקרה העיוורות (17 ו-6, בהתאמה) הופחתו מערכי ה-DPM שהוזכרו להלן.
    [14ג] שריר DPM: 343
    [14ג] DPMמדיה: 11846
    [3ח] שריר DPM: 4467
    [3ח] מדיה DPM: 39814
    Mכרך: 25
    חלבון מ"ג: 0.396 (ב 150 μL חלבון שריר lysate)
    [2-דאוקסי-D-גלוקוז]: 1 (מ"מ)
    Th: 1/6 (h)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0.724 μL
    [3ח] DPMECS: 0.724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
    [3ח] DPMICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    ספיגת גלוקוז: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol / L) / 0.396 מ"ג חלבון) / (1/6 שעה) = 31.53 מיקרומול / גרם חלבון / שעה

9. ניתוחי SDS-PAGE וכתמים מערביים

  1. מכינים את סולאוס ואת שרירי ה-EDL lysates ב-Laemmli buffer ומחממים במשך 5 דקות ב-96 מעלות צלזיוס.
  2. הפרד כמויות שוות של חלבון שריר על ידי SDS-PAGE על ג'לים יצוקים בעצמם והעביר את החלבונים לקרומי פלואוריד פוליווינילידן על ידי כתם סמי-דרי.
  3. לאחר מכן, דגירה של ממברנות ב-Tris-buffered מלוחים המכילים 0.05% Tween 20 ו-2% חלב רזה וממברנות בדיקה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים רלוונטיים.
  4. זהה חלבונים עם chemiluminescence והדמיית אותם על ידי מערכת הדמיה דיגיטלית.

10. גליקוגן שרירים, נוקלאוטידים, לקטט, קריאטין ופוספוקריאטין

  1. השתמש בחומצה פרכלורית כדי לחלץ דגימות שרירי EDL וסולאוס.
  2. לאחר מכן, נטרלו דגימות ונתחו אותן עבור לקטט, קריאטין ופוספוקריאטין כפי שתואר קודם לכן18.
  3. נתחו את תכולת הנוקלאוטידים בשריר ה-EDL והסולאוס על ידי HPLC בפאזה הפוכה לאחר מיצוי בחומצה פרכלורית.
  4. קבע את תכולת הגליקוגן של השריר בהומוגנט של שריר שלם כיחידות גליקוזיל לאחר הידרוליזה של חומצה בשיטה פלואורומטרית כפי שתואר קודם לכן18.

11. סטטיסטיקה

  1. בצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנת ניתוחים סטטיסטיים.
  2. השתמש בניתוח דו-כיווני של מבחן השונות (ANOVA) כדי להעריך הבדלים סטטיסטיים בין ערכים המוצגים בטבלה 1.
  3. השתמש במבחני סטודנט t לא מותאמים כדי להעריך הבדלים סטטיסטיים בספיגת הגלוקוז בין EDL לסולאוס בתוך כל קבוצה המוצגת באיור 2. הצג נתונים כאמצעי ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כפי שניתן לראות באיור 2, שיעורי ספיגת הגלוקוז הבסיסיים היו דומים בין סולאוס מבודד לבין שרירי EDL מנקבות עכברים. זה דווח גם כמה פעמים לפני 12,13,19,20. ספיגת הגלוקוז עלתה בכ-0.8 ופי 0.6 בקירוב והגיעה ל-12 ו-9 מיקרומול/גרם חלבון/שעה בסולאוס ובשריר ה-EDL, בהתאמה, בתגובה לריכוז אינסולין יעיל באופן תת-מקסימלי (100 μU/mL). עלייה זו הייתה גבוהה עוד יותר (פי 4 ו-2 בהתאמה הגיעה ל-33 ו-19 מיקרומול/גרם חלבון/שעה בסולאוס ו-EDL, בהתאמה) כאשר השרירים היו מגורה עם ריכוז אינסולין יעיל ביותר (10 mU/mL). יתר על כן, גם ספיגת גלוקוז תת-מקסימלית וגם ספיגת גלוקוז מקסימלית מגורה אינסולין הייתה גבוהה משמעותית בשריר הסולאוס, מה שמצביע על כך ששריר הסולאוס מפגין רגישות והיענות מוגברת לאינסולין בהשוואה לשריר ה-EDL. זה עשוי להיות קשור לביטוי הגבוה יותר של טרנספורטר הגלוקוז 4 (GLUT4) כמו גם לחלבון מתמר איתות האינסולין קינאז B (Akt) בשריר סולאוס בהשוואה לשריר EDL 10,21,22,23,24.

ספיגת גלוקוז כתוצאה מהתכווצות הייתה גבוהה משמעותית בשרירי ה-EDL בהשוואה לשריר הסולאוס (איור 2) כפי שדווח בעבר גם13,19. לפיכך, ספיגת הגלוקוז עלתה פי 2 ו-2.5 כ-14 ו-22 מיקרומול/גרם חלבון/שעה בסולאוס ובשרירי ה-EDL, בהתאמה, בתגובה להתכווצויות חשמליות. איור 3 מראה ייצור מרבי של כוח שריר בסולאוס ובשרירי EDL במהלך תקופת הגירוי של 10 דקות. כפי שנראה ודווח בעבר19, שריר ה-EDL מייצר יותר כוח (225 mN ב-EDL לעומת 150 mN בסולאוס) במהלך החלק הראשוני של תקופת הגירוי. מצד שני, שריר ה-EDL מפגין ירידה מהירה יותר בייצור הכוח בהשוואה לשריר הסולאוס בהמשך תקופת הגירוי. ממצאים אלה נובעים ככל הנראה מההבדל בהתפלגות סוגי הסיבים בין שריר הסולאוס (סוג 1 > סוג 2) לבין שריר EDL (סוג 2 > סוג 1)25 מכיוון שסיבים מסוג 2 מייצרים יותר כוח אך מתעייפים מהר יותר בהשוואה לסיבים מסוג 126,27.

כדי להעריך את ההשפעה של אינסולין והתכווצות על איתות תוך-תאי בסולאוס מבודד ובשרירי EDL, זרחון של Akt Thr308, TBC1 בן משפחה 4 (TBC1D4) Ser588, AMPKα Thr172 ואצטיל-CoA קרבוקסילאז (ACC) Ser212 בוצע על ידי טכניקת הכתם המערבית (איור 4). כצפוי, ריכוז האינסולין התת-מקסימלי והיעיל ביותר גרם לעלייה בזרחון של Akt Thr308 ו-TBC1D4 Ser588, בעוד שההתכווצות גרמה לעלייה בזרחון של AMPKα Thr172 ו-ACC Ser212. לא אינסולין ולא התכווצות הובילו לשינוי בתכולת החלבון הכוללת של Akt2, TBC1D4, AMPKα2 ו-ACC בסולאוס ובשרירי EDL (איור 4).

בבדיקת סמנים שונים של כדאיות מטבולית של סולאוס דגירה ושרירי EDL, ראינו ירידה כוללת ברמות של נוקלאוטידים אדנוזין (ATP, ADP, AMP) (~15-25%) וכן קריאטין (~10-35%) ללא קשר לשאלה אם השרירים דוגרו בנוכחות פירובט או גלוקוז בהשוואה לשרירים שאינם מדוגרים (טבלה 1 ). מצד שני, הירידה ברמות הגליקוגן שנצפתה בסולאוס ובשרירי EDL עם פירובט נמנעה אם השרירים היו מודגרים עם גלוקוז. עם זאת, באופן מעניין, ראינו שרמות האינוזין מונופוספט (IMP) עלו פי כמה, אך רק בשריר הסולאוס המדגר. רמות IMP בדרך כלל עולות בשרירים במהלך לחץ מטבולי חמור כאשר השריר מנסה למנוע הצטברות AMP על ידי המרת AMP ל- IMP על מנת לשמור על יחס ATP / ADP28. זה מצביע על כך ששריר הסולאוס מעט יותר לחוץ מבחינה מטבולית בהשוואה לשריר ה-EDL במהלך הדגירה. רעיון זה נתמך גם על ידי ממצאים של זרחון מוגבר של AMPKα Thr172 ו-ACC Ser212 בשריר הסולאוס המדגר עם פירובט (איור 5). חשוב לציין כי העלייה הנצפית ברמות IMP, כמו גם בזרחון AMPKα Thr172 ו-ACC Ser212, יורדת כאשר שריר הסולאוס מודגר עם גלוקוז. לפיכך, נראה כי יש יתרון לדגירה של שרירי שלד מבודדים במאגר המכיל גלוקוז כדי למזער תנודות בנוקלאוטידים אדנוזין ולמנוע ירידה בגליקוגן השרירים כאשר השרירים מדוגרים למשך פרק זמן ממושך. לגבי ספיגת 2-דאוקסיגלוקוס, יש לנו עדויות המצביעות על כך שדגירה של שרירים במשך 6 עד 8 שעות בנוכחות פירובט תגדיל את שיעורי ספיגת הגלוקוז הבסיסית/מנוחה. נראה כי דגירה של שרירים במדיה המכילה גלוקוז מונעת עלייה כזו בספיגת הגלוקוז (נתונים שלא פורסמו).

Figure 1
איור 1: מערכת דגירה. (A) מערכת מיוגרפיה עם ארבעה תאי דגירה בודדים. (B) ווי דגירה מותאמים אישית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: ספיגת גלוקוז בשרירי שלד בוגרים מבודדים מעכברים. ספיגת 2-דאוקסיגלוקוס נקבעה בשרירי סולאוס (פסים שחורים) ו-EDL (פסים אפורים) מבודדים בתגובה לריכוז אינסולין יעיל באופן תת-מקסימלי (100 μU/mL), ריכוז אינסולין יעיל ביותר (10 mU/mL) והתכווצויות המושרות חשמלית (0.2 אלפיות השנייה דופק, 100 הרץ, 1 s/15s, 30 V, 10 דקות). הנתונים נותחו על ידי תלמידים t מבחן בתוך כל קבוצה. ###p<0.001, ##p<0.01 לעומת שריר סולאוס. ערכים הם אמצעים ± SEM. n = 4-6 לכל קבוצה. ח, שעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: עקומות כוח השריר בתגובה להתכווצויות המושרות חשמלית. שיא ייצור הכוח במהלך גירוי חשמלי חושב עבור שריר הסולאוס (נקודות שחורות) ו-EDL (נקודות אפורות). כל ערך בודד מתאים לממוצע של 500 אלפיות השנייה האחרונות של כל תקופת גירוי של 1 שניות. ערכים הם אמצעים ± SEM. n = 5-6 לכל קבוצה. s, שנית. mN, מילי-ניוטון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: כתמים מערביים מייצגים של Akt Thr308, TBC1D4 Ser588, AMPKα Thr172 וזרחון ACC Ser212 וכן חלבון Akt2, TBC1D4, AMPKα2 ו-ACC. ניתוחי כתמים מערביים בוצעו בדגימות של סולאוס עכברים ושרירי EDL שתוארו באיור 2. B, בסיסי. S, אינסולין יעיל באופן תת-מקסימלי. M, אינסולין יעיל ביותר. ג, התכווצות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: כתמים מערביים מייצגים של זרחון AMPKα Thr172 ו-ACC Ser212, כמו גם של חלבון AMPKα2 ו-ACC. ניתוחי כתמים מערביים בוצעו בדגימות של סולאוס עכברים ושרירי EDL המתוארים בטבלה 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

לא דגירה דגירה של שעה אחת עם פירובט דגירה של שעה אחת עם גלוקוז השפעות עיקריות אינטראקציה
סולאוס EDL סולאוס EDL סולאוס EDL
לקטט 1.00 ± 0.01 1.00 ± 0.02 0.96 ± 0.03 0.98 ± 0.02 1.05 ± 0.01 0.99 ± 0.01 - -
Cr 1.00 ± 0.04 1.00 ± 0.06 0.64 ± 0.07 ### 0.76 ± 0.05 ### 0.76 ± 0.07 ## 0.88 ± 0.09 ## עמ' < 0.001 -
PCr 1.00 ± 0.19 1.00 ± 0.06 0.80 ± 0.12 1.13 ± 0.14 0.65 ± 0.31 0.75 ± 0.08 - -
PCr/(Cr + PCr) 1.00 ± 0.20 1.00 ± 0.07 1.17 ± 0.11 1.25 ± 0.12 0.78 ± 0.36 0.92 ± 0.11 - -
ATP 1.00 ± 0.03 1.00 ± 0.02 0.72 ± 0.03 ###,§§§ 0.99 ± 0.03 * 0.81 ± 0.06 ### 0.85 ± 0.04 ## - עמ' < 0.001
ADP 1.00 ± 0.04 1.00 ± 0.04 0.75 ± 0.05 ### 0.92 ± 0.03 ### 0.84 ± 0.04 ## 0.86 ± 0.03 ## עמ' < 0.001 -
המגבר 1.00 ± 0.11 1.00 ± 0.12 0.85 ± 0.15 0.79 ± 0.13 0.84 ± 0.18 0.75 ± 0.13 - -
IMP 1.00 ± 0.17 1.00 ± 0.30 4.43 ± 0.67 ###,§§§ 0.72 ± 0.29 3.33 ± 1.25 ##,§ 1.08 ± 0.01 - עמ' < 0.001
יחס AMP/ATP 1.00 ± 0.12 1.00 ± 0.13 1.18 ± 0.22 0.81 ± 0.16 1.06 ± 0.23 0.90 ± 0.19 - -
גליקוגן 1.00 ± 0.08 1.00 ± 0.12 0.74 ± 0.07 (#),* 0.80 ± 0.12 (#),* 1.12 ± 0.10 1.10 ± 0.03 p = 0.035 -
pAMPK Thr172 / AMPKα2 1.00 ± 0.10 1.00 ± 0.12 3.26 ± 0.58 ###,***,***,§§§ 1.55 ± 0.27 1.68 ± 0.19 # 1.36 ± 0.19 - p = 0.002
pACC Ser212 / ACC 1.00 ± 0.18 1.00 ± 0.12 2.22 ± 0.58 ###,**,**,§§ 0.96 ± 0.21 0.99 ± 0.15 0.83 ± 0.09 - p = 0.030

טבלה 1: השוואה בין הכדאיות המטבולית של סולאוס עכבר ושרירי EDL דגירה במשך שעה בנוכחות 2 mM pyruvate או 5 mM גלוקוז. שרירים שאינם מודגרים נותחו מבעלי חיים שעברו הרדמה והאכילו אותם לפני שהוקפאו בחנקן נוזלי. שרירים נפרדים דוגרו במשך שעה אחת במאגר KRH בתוספת BSA (0.1%), Na-pyruvate (2 mM) ו-D-mannitol (8 mM) בעוד שאחרים דוגרו במשך שעה אחת ב-KRH buffer בתוספת BSA (0.1%), D-גלוקוז (5 mM) ו-D-מניטול (5 mM) לפני שהוקפאו בחנקן נוזלי. הנתונים הומרו ליחידות יחסיות כדי להדגיש את השינויים שנצפו בסמנים שונים של כדאיות מטבולית. ערכים מוחלטים משרירי סולאוס ו-EDL של עכברים שאינם מדוגרים ניתנים להלן. לקטט (mmol/kg w.w): 137.53סולאוס; 139.05EDL. Cr (mmol/kg w.w): 9.35סולאוס; 8.98אדל. PCr (mmol/kg w.w): 1.50סולאוס; 5.20EDL. PCr/(PCr+Cr): 13.98סולאוס; 37.30EDL. ATP (mmol/kg w.w): 3.07סולאוס; 4.24אדל. ADP (mmol/kg w.w): 0.60סולאוס; 0.51EDL. AMP (mmol/kg w.w): 0.18סולוס; 0.08אדל. IMP (mmol/kg w.w): 0.07סולאוס; 0.14EDL. יחס AMP/ATP: 0.06סולוס; 0.02EDL. גליקוגן (חלבון פמול/מיקרוגרם): 77.01סולאוס; 67.56אדל. הנתונים נותחו על ידי ANOVA דו-כיווני בתוך כל קבוצה. ###p<0.001, ##p<0.01, ו-#p<0.05 לעומת לא דגירה. p<0.001, **p<0.01 ו-*p<0.05 לעומת דגירה של שעה אחת עם גלוקוז. §§§p<0.001, §§p<0.01, ו-§p<0.05 לעומת EDL. ערכים פירושם ± SEM. n = 12 בקבוצה שאינה דגירה, n = 4-6 בקבוצות דגירה. Cr, קריאטין; PCr, פוספוקריאטין; w.w, משקל רטוב; ח, שעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ויסות שלם של ספיגת הגלוקוז בשרירי השלד חשוב לשמירה על הבריאות הכללית1. לפיכך, חקר ספיגת הגלוקוז בשרירים משמש לעתים קרובות כקריאה ראשונית בעת הערכת התערבויות שונות המשנות את הבריאות. כאן אנו מתארים שיטת ex vivo למדידת ספיגת גלוקוז בסולאוס מבודד ודגירה ושרירי EDL מעכברים בתגובה לאינסולין והתכווצויות חשמליות. השיטה מהירה ואמינה ומאפשרת שליטה מדויקת על הסביבה של השריר המדגר המאפשרת חקירות מדויקות של שיעורי ספיגת הגלוקוז בשרירים שבודדו מההשפעה המבלבלת הפוטנציאלית של הורמונים ומצעים שניתן למצוא בדם. השיטה שימשה במשך מספר שנים במחקרים רבים ואומצה באופן נרחב על ידי קהילת חקר השרירים.

מודל הדגירה של ex vivo נחשב בדרך כלל לשיטה להערכת יכולת הובלת גלוקוז ולא ספיגת גלוקוז בשרירי השלד. ניתן לקבוע את יכולת הובלת הגלוקוז בשרירים דגירה על ידי מדידת D-גלוקוז מצטבר לאורך זמן. עם זאת, זה מהווה בעיה כמו D-גלוקוז הוא מטבוליזם במהירות בתא השריר לאחר ספיגה. כדי לעקוף בעיה זו, אנלוגי הגלוקוז 3-O-Methyl-D-גלוקוז (3-MG) כבר בשימוש נרחב כדי להעריך את יכולת הובלת גלוקוז, כמו 3-MG אינו מטבוליזם נוסף בתוך התא לאחר מועבר על פני קרום פני השטח של התא. לפיכך, הקצב ההתחלתי של 3-MG מצטבר תוך תאי משמש כמדד של יכולת הובלת גלוקוז תאי כשלעצמו מכיוון שהוא אינו מושפע משלבים אחרים במסלולים המטבוליים של הגלוקוז. עם זאת, השימוש ב- 3-MG עשוי להוות בעיה שכן 3-MG יצטבר ובכך יפחית את שיפוע הטרנס-ממברנה עבור 3-MG ולאחר מכן יפחית ספיגה נוספת. לפיכך, כדי לקבל מדידה של יכולת הובלת הממברנה, יש להעריך את הקצב ההתחלתי של קליטת 3-MG. בפרט כאשר כושר ההובלה גבוה זה עלול להוות בעיה עקב שטף של 3-MG מהשריר29,30. ניתן להימנע מהבעיה הפוטנציאלית עם שטף 3-MG באמצעות 2-deoxy-D-גלוקוז (2-DG). לאחר הובלה לשריר השלד, 2-DG הוא זרחן על ידי hexokinase II ל 2-deoxy-D-גלוקוז-6-פוספט (2-DG-6P). מכיוון ששרירי השלד חסרים גלוקוז-6-phophatase ו-GLUT4 אינו יכול להעביר זרחן 2-DG, 2-DG-6P יהיה כלוא בתוך תא השריר. בניגוד לגלוקוז-6-פוספט, 2-DG-6P הוא מעכב אלוסטרי חלש מאוד של hexokinase II30 אשר מסייע לשמור על שיפוע transmembrane עבור 2-DG. לפיכך, תצפיות הראו כי ספיגת 2-DG בשריר דגירה (חולדה) נשארת ליניארית עד שריכוז 2-DG-6P התוך-תאי עולה על 30 mM, ריכוז שמוריד את פעילות ההקסוקינאז II30. יתר על כן, בשריר השלד של העכבר דגירה ספיגת 2-DG נשארת ליניארית במשך כ-30 דקות כאשר הטמפרטורות של מאגרי הדגירה הן 37 מעלות צלזיוס או פחות31. זה מצביע על כך שניתן להשתמש ב-2-DG למדידת יכולת הובלת גלוקוז ולא ספיגת גלוקוז בשריר דגירה, למעט מצבים שבהם ריכוזי 2-DG-6P הופכים לגבוהים מאוד (למשל נצפו במהלך הדגירות >שעתיים עם 1 mM 2-DG וריכוז אינסולין מקסימלי29,30). הרעיון שספיגת 2-DG משקפת ככל הנראה את יכולת הובלת הגלוקוז נתמכת גם על ידי ממצאים המראים כי ספיגה מקסימלית של 2-DG מגורה באינסולין דומה בשרירים דגירה מעכברים מסוג בר ועכברים המבטאים יתר על המידה את ההקסוקינאז II32. דאגה פוטנציאלית בעת שימוש ב-2-DG למדידות הובלת גלוקוז בשרירים במהלך התכווצות היא עלייה בריכוז הגלוקוז-6-פוספט התוך-תאי עקב קצב גבוה של גליקוגנוליזה. עם זאת, מאחר שעלייה ליניארית בספיגת שריר 2-DG (חולדה) נצפתה במהלך ההתכווצות לאורך זמן29, הדבר מצביע על כך שהצטברות של גלוקוז-6-פוספט מהתפרקות הגליקוגן במהלך ההתכווצות אינה מפריעה לפעילות ההקסוקינאז II ולכן שיעורי הספיגה של 2-DG. בהתבסס על כך, 2-DG נראה מתאים היטב למדידות של הובלת גלוקוז בשרירי שלד מבודדים במהלך אינסולין והתכווצות בהתחשב במגבלות של 3-MG.

למרות שההנחה הרווחת היא כי 2-DG אינו מטבוליזם נוסף לאחר זרחון על ידי hexokinase II, דווח כי כמה 2-DG מופנה כלפי ושולב לתוך glycogen שריר. לפיכך, במהלך מהדק היפר-אינסולינמי נורמוגליקמי של 2 שעות בחולדות כ-30% מה-2-DG שנלקח על ידי שרירי השלד משולב בגליקוגן33. לכן, ניתן לנמק זאת בכך ששיעורי ספיגת 2-DG מגורה אינסולין בשרירי השלד המדגרים מוערכים בחסר אם הצטברות של 2-DG בגליקוגן מוזנחת. קבענו כי הפרוטוקול המתואר כאן כיצד להכין ליאסטים של שרירים (סופרנאטנט) לניתוחים מאוחרים יותר של שיעורי ספיגה של 2-DG בשרירי שלד דגירה קודמים אינו מושפע מהשילוב הפוטנציאלי של 2-DG בגליקוגן. ניתן לטעון כי גליקוגן מצטבר בכדור בעת צנטריפוגה של שריר שלם הומוגנט כדי לייצר ליזאט למדידות ספיגה של 2-DG. עם זאת, כאשר משווים את רמות הרדיואקטיביות בהומוגנט שריר שלם מגורה באינסולין לעומת ליזט איננו מזהים הבדל משמעותי (נתונים שלא פורסמו). זה מצביע על כך שדגירה של שריר העכבר למשך 10 דקות ב-1 mM של 2-DG אינה גורמת להצטברות ניתנת לזיהוי של 2-DG בגליקוגן.

קביעת ספיגת שרירי השלד 2-DG מבלי לקחת בחשבון ש-2-DG מופץ הן במרחב החוץ-תאי והן במרחב התוך-תאי תוביל להערכת יתר של ספיגת 2-DG. כדי לעקוף זאת, יש להשתמש ב-L-גלוקוז כסמן חוץ-תאי מכיוון שהוא אינו מועבר על פני קרום התא אלא מפגין תכונות דומות כמו D-גלוקוז כולל מסה, מסיסות, דיפוזיה פסיבית, קשירה וכו '. בשל העלויות המופרזות של הייצור ובכך רכישת L-גלוקוז, מניטול משמש בדרך כלל כסמן חוץ-תאי מכיוון שהמניטול אינו נקלט על ידי תא השריר, הוא זול יחסית ומוערך כבעל נפח התפלגות חוץ-תאי דומה במקצת לגלוקוז ו-2-DG34.

נראה כי שעונים תאיים ומולקולריים פנימיים ממלאים תפקיד חיוני בוויסות חילוף החומרים של כל הגוף והומאוסטזיס אנרגטי35. נצפה כי נוקאאוט ספציפי לשריר של גן השעון הליבה Bmal1 פוגע בספיגת גלוקוז מגורה אינסולין בשריר שלד עכבר מבודד36. יתר על כן, ספיגת גלוקוז מגורה אינסולין תת-מקסימלית של שרירי שלד מבודדים מציגה את השעון הביולוגי עם תגובת האינסולין הנמוכה והגבוהה ביותר באמצע השלב הבהיר והחשוך, בהתאמה37. בהתבסס על ממצאים אלה, לכן חשוב לשלב זמן של הקרבת בעלי חיים בתכנון הניסוי כדי להגדיל את יכולת השחזור של הנתונים.

חיסרון עיקרי של שיטת ex vivo הוא היעדר זרימה נימית בשריר המבודד. משמעות הדבר היא כי אספקה והסרה של מצעים שונים תלויים לחלוטין בדיפוזיה פשוטה בין סיבי השריר לסביבה. כתוצאה מכך, אימות הכדאיות המטבולית של שריר מבודד דגירה ex vivo התמקד במגבלות דיפוזיה של חמצן לסיבי שריר שטחיים כמו גם עמוקים. לפיכך, שריר דגירה, במיוחד שריר עכבר מטבולי מאוד, נוטה לפתח ליבות היפוקסיות שבהן פירוק של גליקוגןמתרחשת 16,17,38. בסקירה מפורטת של בון ועמיתיו15, הוצע כי ליבות היפוקסיות של שריר דגירה ככל הנראה להתפתח כאשר שריר דגירה עבה מכדי להיות מחומצן כראוי במיוחד כאשר דגירה בטמפרטורות של ≥ 37 מעלות צלזיוס. זה הוביל להמלצה כי רק שרירי עכבר דקים וצילינדריים, כגון soleus ו- EDL, צריכים לשמש לדגירות בטמפרטורה של 25-30 מעלות צלזיוס כדי למנוע התפתחות של ליבות היפוקסיות. זה מצביע על כך שעובי וגיאומטריה ולא מסה הם גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת דגירה של שרירי השלד של העכבר. בנוסף, הומלץ כי יש למדוד ולדווח באופן שגרתי על טמפרטורת הדגירה, עובי השרירים, כמו גם ATP, פוספוקריאטין וגליקוגן ו/או שחרור לקטט כדי להעריך באופן שגרתי את הכדאיות של השריר המדגר15. למיטב ידיעתנו, ניתוחים מלאים כאלה של שריר דגירה דווחו בעיקר עבור שרירי חולדה 39,40,41,42 ורק במידה מוגבלת דווחו עבור שריר העכבר 16,17. כדי להגביר את התובנה לגבי סמנים מטבוליים שונים של כדאיות בשרירי שלד עכברים דגירה, הערכנו שינויים אפשריים בתכולת התכולה התוך-תאית של לקטט, קריאטין, פוספוקריאטין, נוקלאוטידים אדנוזין, גליקוגן ואיתות AMPK בשריר סולאוס ו-EDL לאחר שעה של דגירה במאגר KRH בתוספת גלוקוז או פירובט. בדומה לממצאים קודמים ב-soleus עכברים דגירה ובשריר EDL17, ראינו שרמות הגליקוגן ירדו כאשר השרירים דוגרו במדיה נטולת גלוקוז. זה מצביע על כך שהיעדר גלוקוז במהלך הדגירה מקדם פירוק גליקוגן ואת הכניסה שלאחר מכן של גלוקוז-6-פוספט לתוך הגליקוליזה שעשויה לפעול כדי להבטיח ייצור ATP בפרט אם אספקת החמצן אינה מספקת. יתר על כן, מצאנו ירידה כוללת במאגרי הנוקלאוטידים ATP וה-ADP בסולאוס דגירה ובשרירי EDL. זה עשוי לרמוז כי אספקת חמצן אינו מספיק לחלוטין כדי לענות על הביקוש של שריר עכבר דגירה הן בנוכחות והן בהיעדר גלוקוז. מכיוון ששריר הסולאוס החמצוני מסתמך יותר על חמצן לייצור ATP בהשוואה לשריר ה-EDL הגליקוליטי, הדבר מצביע על כך ששריר הסולאוס מושפע במידה רבה יותר מהליך הדגירה. בהסכמה, מצאנו כי הרמות התוך-תאיות של IMP, כמו גם איתות AMPK, עלו במידה ניכרת בסולאוס בהשוואה לשריר ה-EDL כאשר דוגרו בהיעדר גלוקוז. זה מסמל כי שריר הסולאוס מפגין רמה גבוהה יותר של מתח מטבולי במהלך הדגירה, אשר יש לקחת בחשבון בעת הערכת נתונים ממודל השרירים של עכבר ex vivo.

תאי שריר בתרבית, כולל L6 ו-C2C12 מונצחים, כמו גם מיוטובים אנושיים ראשוניים, משמשים בדרך כלל כפונדקאית לשרירי שלד בוגרים כדי לחקור את ההשפעות של מניפולציות גנטיות ופרמקולוגיות שונות על ספיגת גלוקוז בשרירים מגורה באינסולין. עם זאת, במספר דרכים תאי שריר בתרבית אינם דומים לשריר השלד הבשל וכאשר משווים בין שתי מערכות המודלים מתגלים הבדלים רבים. אלה כוללים הבדלים בביטוי חלבונים, מבנה ממדי, סביבה, מצב התפשטות והתמיינות, הרכב סוג סיבים, תהליכים מטבוליים ותכונות תפקודיות43 כל אלה עשויים להשפיע על האופן שבו תא השריר מווסת את ספיגת הגלוקוז בתגובה לגירויים שונים. בדרך כלל, השפעות יחסיות גבוהות יותר של אינסולין על שיעורי ספיגת הגלוקוז נצפות בשרירי שלד בוגרים בהשוואה לתאי שריר בתרבית44 , מה שעשוי להצביע על כך שתאי שריר בתרבית חסרים במידה מסוימת את המנגנון האחראי לוויסות שיעורי ספיגת הגלוקוז, כולל רמה גבוהה של ביטוי של טרנספורטר הגלוקוז הרגיש לאינסולין GLUT443 . בהתחשב במגבלות ובאזהרות הקשורות לשימוש בתאי שריר בתרבית ובשרירי שלד מבודדים, סביר להניח שיהיה זה יתרון לנקוט בגישה משולבת כאשר חוקרים תהליכים מטבוליים שונים בשרירים כגון ספיגת גלוקוז.

שרירי סולאוס ו-EDL נחשבים בדרך כלל כמייצגים של שרירי עוויתות איטיות ומהירות, בהתאמה. לכן, סוגי שרירים אלה אידיאליים למחקרים מכניים המבקשים לחקור התערבויות המשפיעות על כוח השריר והתפתחות העייפות. יתר על כן, שריר סולאוס מדווח בדרך כלל כבעל רגישות והיענות מוגברת לאינסולין בהשוואה לשריר EDL ולכן, התערבויות המכוונות לרגישות לאינסולין בשרירים עשויות להשפיע באופן שונה על סולאוס ו-EDL. בנוסף, ההתפלגות היחסית של מתחמי AMPK השונים שונה בין שריר הסולאוס לשריר ה-EDL, שככל הנראה משפיע על יכולתם של תרכובות המפעילות AMPK להגביר את ספיגת הגלוקוז בשרירים. לפיכך, התובנה הגדולה ביותר לגבי ויסות ספיגת הגלוקוז בשרירים תושג ככל הנראה אם גם שרירי הסולאוס וגם שרירי ה-EDL משמשים במהלך הניסויים במודל הדגירה ex vivo.

השיטה המתוארת כאן מתייחסת לספיגת הגלוקוז לכמות שפע החלבון הכולל שנקבעה בכל דגימת שריר לאחר הומוגניזציה. מניסיוננו, הווריאציה פוחתת כאשר מתייחסים לספיגת גלוקוז לכמות חלבון שריר במקום למשקל שריר (נתונים שלא פורסמו). יתר על כן, הומוגניזציה של דגימות שרירים במאגר המשמש לבדיקות ביוכימיות שונות מאפשרת לקבוע הן את ספיגת הגלוקוז, את האיתות המיו-תאי והן את פעילות האנזים באותה הכנת דגימה45,46. זה יקטין לעתים קרובות את כמות העכברים המשמשים למחקר. עם זאת, ספיגת גלוקוז יכולה להיקבע בקלות בדגימות שרירי השלד המומסות על ידי חימום בנתרן הידרוקסיד (NaOH) ולאחר מכן נטרול עם מימן כלורי20. מאחר שהטיפול בשריר ב-NaOH מפריע למדידות של ריכוז החלבון הכולל בשריר, הובלת הגלוקוז הנמדדת בהליך זה חייבת להיות קשורה למשקל השריר.

בהתבסס על אופטימיזציות שונות, מאגר הדגירה שלנו לספיגת גלוקוז מכיל פעילות ספציפית של 0.028 MBq/mL של [3H]2-deoxy-D-גלוקוז ו-0.0083 MBq/mL של [14C] מניטול. מצד אחד, זה מוריד את כמות הליזאט (150 מתוך 400 μL) הדרושה כדי לקבל מדידות רדיואקטיביות מספיקות ואמינות. מצד שני, הוא מגדיל את כמות המניטול הרדיואקטיבי [3H]2-deoxy-D-glucose ו-[14C]מניטול הדרוש לכל ניסוי, מה שמגדיל את עלויות הניסוי. לפיכך, עבור כל מערך ניסיוני ניתן לווסת את כמות הרדיואקטיביות המשמשת במדיית הדגירה של ספיגת הגלוקוז כך שתתאים לדרישות ספציפיות. עם זאת, יש להיזהר שלא להקטין את כמות הרדיואקטיביות במאגר הדגירה במידה שהופכת את מדידות הרדיואקטיביות לבלתי אמינות. זה מובטח על ידי שמירה על רדיואקטיביות בדגימות גבוהות יותר ממגבלות הגילוי שצוינו של מכונות ספירת הניצוץ הנוזלי המשמשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמועצה הדנית למחקר עצמאי - מדעי הרפואה (FSS8020-00288B) ומקרן נובו נורדיסק (NNF160C0023046). עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק מחקר לרסמוס Kjøbsted מהאקדמיה הדנית לסוכרת, הממומנת על ידי קרן נובו נורדיסק, מענק מספר NNF17SA0031406. המחברים רוצים להודות לקרינה אולסן, בטינה בולמגרן ואיירין בק נילסן (המחלקה לתזונה, התעמלות וספורט, הפקולטה למדעים, אוניברסיטת קופנהגן) על הסיוע הטכני המיומן שלהן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[14C]D-mannitol American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose  American Radiolabeled Chemicals, Inc. ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose Sigma D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture Harvard Apparatus 51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate) DAKO P0397 Used to detect ACC protein
Akt2 antibody Cell Signaling 3063
AMPKα2 antibody Santa Cruz SC-19131
aprotinin Sigma A1153
benzamidine Sigma B6505
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
CaCl2 Merck 1020831000
Calibration kit (force) Danish Myo Technology A/S 300041
Chemiluminescence Millipore WBLUF0500
D-Glucose Merck 1084180100
D-Mannitol Sigma M4125
Data collection program National Instruments LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing Visking DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system BioRad ChemiDoc MP
EDTA Sigma EDS E9884
EGTA Sigma E4378
Electrical Pulse Stimulator Digitimer D330 MultiStim System
Glycerol Sigma G7757
HEPES Sigma H7637
IGEPAL CA-630  Sigma I8896
Insulin Novo Nordisk Actrapid, 100 IE/mL
KCl Merck 1049361000
KH2PO4 Merck 104873025
leupeptin Sigma L2884
MgSO4 Merck 1058860500
Muscle Strip Myograph System Danish Myo Technology A/S Model 820MS
Na-Orthovanadate Sigma S6508
Na-Pyrophosphate Sigma 221368
Na-Pyruvate Sigma P2256
NaCl Merck 106041000
NaF Sigma S1504
NaHCO3 VWR 27778260
pACC Ser212 antibody Cell Signaling 3661
pAkt Thr308 antibody Cell Signaling 9275
pAMPK Thr172 antibody Cell Signaling 2531
phenylmethylsulfonylfluoride Sigma P7626
Platinum electrodes Danish Myo Technology A/S 300145
pTBC1D4 Ser588 antibody Cell Signaling 8730
Scintillation counter Perkin Elmer Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid  Perkin Elmer 6013329
Statistical analyses software Systat SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody Abcam ab189890
TissueLyser II  Qiagen 85300
Ultrapure water Merck Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate Sigma G9422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, suppl_2 157-163 (2009).
  2. Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feeding during prolonged strenuous exercise can delay fatigue. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 55 (1), Pt 1 230-235 (1983).
  3. Kim, J. K. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp to assess insulin sensitivity in vivo. Methods in Molecular Biology. 560, 221-238 (2009).
  4. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  5. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiological Reviews. 93 (3), 993-1017 (2013).
  6. Sanders, C. A., Levinson, G. E., Abelmann, W. H., Freinkel, N. Effect of exercise on the peripheral utilization of glucose in man. The New England Journal of Medicine. 271, 220-225 (1964).
  7. Barrington, S. F., Maisey, M. N. Skeletal muscle uptake of fluorine-18-FDG: effect of oral diazepam. Journal of Nuclear Medicine Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 37 (7), 1127-1129 (1996).
  8. Fentz, J., et al. AMPKα is critical for enhancing skeletal muscle fatty acid utilization during in vivo exercise in mice. FASEB Journal. 29 (5), 1725-1738 (2015).
  9. Maarbjerg, S. J., et al. Genetic impairment of AMPKalpha2 signaling does not reduce muscle glucose uptake during treadmill exercise in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 924-934 (2009).
  10. Stöckli, J., et al. The RabGAP TBC1D1 plays a central role in exercise-regulated glucose metabolism in skeletal muscle. Diabetes. 64 (6), 1914-1922 (2015).
  11. Jørgensen, S. B., et al. Knockout of the alpha2 but not alpha1 5'-AMP-activated protein kinase isoform abolishes 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranosidebut not contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. The Journal of Biological Chemistry. 279 (2), (2004).
  12. Kjøbsted, R., et al. Prior AICAR stimulation increases insulin sensitivity in mouse skeletal muscle in an AMPK-dependent manner. Diabetes. 64 (6), 2042-2055 (2015).
  13. Lantier, L., et al. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity. FASEB Journal. 28 (7), 3211-3224 (2014).
  14. Cokorinos, E. C., et al. Activation of skeletal muscle AMPK promotes glucose disposal and glucose lowering in non-human primates and mice. Cell Metabolism. 25 (5), 1147-1159 (2017).
  15. Bonen, A., Clark, M. G., Henriksen, E. J. Experimental approaches in muscle metabolism: hindlimb perfusion and isolated muscle incubations. The American Journal of Physiology. 266, 1-16 (1994).
  16. van Breda, E., Keizer, H. A., Glatz, J. F., Geurten, P. Use of the intact mouse skeletal-muscle preparation for metabolic studies. Evaluation of the model. The Biochemical Journal. 267 (1), 257-260 (1990).
  17. Sogaard, P., et al. Effects of fibre type and diffusion distance on mouse skeletal muscle glycogen content in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (6), 1189-1197 (2009).
  18. Lowry, O. H., Passonneau, J. V. Typical fluorometric procedures for metabolite assays. A Flexible System of Enzymatic Analysis. , 68-92 (1972).
  19. Jensen, T. E., et al. Contraction-stimulated glucose transport in muscle is controlled by AMPK and mechanical stress but not sarcoplasmatic reticulum Ca(2+) release. Molecular Metabolism. 3 (7), 742-753 (2014).
  20. Kristensen, J. M., Treebak, J. T., Schjerling, P., Goodyear, L., Wojtaszewski, J. F. P. Two weeks of metformin treatment induces AMPK-dependent enhancement of insulin-stimulated glucose uptake in mouse soleus muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (10), 1099-1109 (2014).
  21. Szekeres, F., et al. The Rab-GTPase-activating protein TBC1D1 regulates skeletal muscle glucose metabolism. AJP: Endocrinology and Metabolism. 303 (4), 524-533 (2012).
  22. Pehmøller, C., et al. Genetic disruption of AMPK signaling abolishes both contraction- and insulin-stimulated TBC1D1 phosphorylation and 14-3-3 binding in mouse skeletal muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297 (3), 665-675 (2009).
  23. Ryder, J. W., Bassel-Duby, R., Olson, E. N., Zierath, J. R. Skeletal muscle reprogramming by activation of calcineurin improves insulin action on metabolic pathways. The Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44298-44304 (2003).
  24. Long, Y. C., Glund, S., Garcia-Roves, P. M., Zierath, J. R. Calcineurin regulates skeletal muscle metabolism via coordinated changes in gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 282 (3), 1607-1614 (2007).
  25. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PloS One. 7 (4), 35273 (2012).
  26. Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
  27. Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
  28. Tullson, P. C., Terjung, R. L. Adenine nucleotide metabolism in contracting skeletal muscle. Exercise and Sport Sciences Reviews. 19, 507-537 (1991).
  29. Wojtaszewski, J. F., Jakobsen, A. B., Ploug, T., Richter, E. A. Perfused rat hindlimb is suitable for skeletal muscle glucose transport measurements. The American Journal of Physiology. 274 (1), Pt 1 184-191 (1998).
  30. Hansen, P. A., Gulve, E. A., Holloszy, J. O. Suitability of 2-deoxyglucose for in vitro measurement of glucose transport activity in skeletal muscle. Journal of AppliedPhysiology. 76 (2), 979-985 (1994).
  31. Watson-Wright, W. M., Tan, M. H., Bonen, A. Insulin binding and 2-deoxy-D-glucose uptake in fast- and slow-twitch mouse skeletal muscle at 18 and 37 degrees C. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 62 (12), 1460-1465 (1984).
  32. Hansen, P. A., Marshall, B. A., Chen, M., Holloszy, J. O., Mueckler, M. Transgenic overexpression of hexokinase II in skeletal muscle does not increase glucose disposal in wild-type or Glut1-overexpressing mice. The Journal of Biological Chemistry. 275 (29), (2000).
  33. Virkamäki, A., Rissanen, E., Hämäläinen, S., Utriainen, T., Yki-Järvinen, H. Incorporation of [3-3H]glucose and 2-[1-14C]deoxyglucose into glycogen in heart and skeletal muscle in vivo: implications for the quantitation of tissue glucose uptake. Diabetes. 46 (7), 1106-1110 (1997).
  34. Bhave, G., Neilson, E. G. Body fluid dynamics: back to the future. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 22 (12), 2166-2181 (2011).
  35. Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Metabolism and the circadian clock converge. Physiological Reviews. 93 (1), 107-135 (2013).
  36. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Molecular Metabolism. 3 (1), 29-41 (2014).
  37. Basse, A. L., et al. Skeletal muscle insulin sensitivity show circadian rhythmicity which is independent of exercise training status. Frontiers in Physiology. 9, 1198 (2018).
  38. Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 248 (3), 265-270 (1985).
  39. Wallberg-Henriksson, H. Glucose transport into skeletal muscle. Influence of contractile activity, insulin, catecholamines and diabetes mellitus. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 564, 1-80 (1987).
  40. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
  41. Cleland, P. J., Rattigan, S., Clark, M. G. Glucose-induced loss of exercise-mediated 3-0-methyl glucose uptake by isolated rat soleus and epitrochlearis muscles. Hormone and Metabolic Research. 22 (2), 121-122 (1990).
  42. Gulve, E. A., Cartee, G. D., Holloszy, J. O. Prolonged incubation of skeletal muscle in vitro: prevention of increases in glucose transport. The American Journal of Physiology. 261 (1), Pt 1 154-160 (1991).
  43. Deshmukh, A. S., et al. Deep proteomics of mouse skeletal muscle enables quantitation of protein isoforms, metabolic pathways, and transcription factors. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 841-853 (2015).
  44. Rudich, A., Klip, A. Push/pull mechanisms of GLUT4 traffic in muscle cells. Acta physiologica Scandinavica. 178 (4), 297-308 (2003).
  45. Kjøbsted, R., et al. Enhanced muscle insulin sensitivity after contraction/exercise is mediated by AMPK. Diabetes. 66 (3), 598-612 (2017).
  46. Kjøbsted, R., et al. TBC1D4 is necessary for enhancing muscle insulin sensitivity in response to AICAR and contraction. Diabetes. 68 (9), 1756-1766 (2019).

Tags

ביולוגיה גיליון 171 שרירי שלד הובלת גלוקוז ספיגת גלוקוז רגישות לאינסולין כיווץ אקספלנט ex vivo מבחנה דגירה מעקבי גלוקוז רדיואקטיביים 2-deoxy-D-גלוקוז
מדידת ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין ובהתכווצות בשרירי שלד בוגרים מבודדים ומדגרים מעכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, … More

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, J. K., Jørgensen, N. O., Birk, J. B., Hellsten, Y., Wojtaszewski, J. F. P. Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice. J. Vis. Exp. (171), e61398, doi:10.3791/61398 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter