In Vivo intrazelluläre Aufzeichnung von typidentifizierten Ratten-Spinal-Motoneuronen während der Trans-Spinal-Gleichstromstimulation
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die intrazelluläre In-vivo-Aufzeichnung von Rattenlenden-Motoneuronen mit gleichzeitiger transspinaler Gleichstromstimulation. Die Methode ermöglicht es uns, Membraneigenschaften zu messen und rhythmisches Abfeuern von Motoneuronen vor, während und nach der anodalen oder kathhodalen Polarisation des Rückenmarks aufzuzeichnen.
Abstract
Die intrazelluläre Aufzeichnung von Spinal-Motoneuronen in vivo bietet einen “Goldstandard” zur Bestimmung der elektrophysiologischen Eigenschaften der Zellen im intakten Wirbelsäulennetz und bietet erhebliche Vorteile gegenüber klassischen in vitro oder extrazellulären Aufzeichnungstechniken. Ein Vorteil von intrazellulären In-vivo-Aufnahmen ist, dass diese Methode an erwachsenen Tieren mit einem vollausgereiften Nervensystem durchgeführt werden kann, und daher können viele beobachtete physiologische Mechanismen in praktische Anwendungen übersetzt werden. In diesem methodischen Papier beschreiben wir dieses Verfahren in Kombination mit extern angewendeter konstanter Strömungsstimulation, die Polarisationsprozesse in spinalen neuronalen Netzwerken imitiert. Die transspinale Gleichstromstimulation (tsDCS) ist eine innovative Methode, die zunehmend als neuromodulatorische Intervention in der Rehabilitation nach verschiedenen neurologischen Verletzungen sowie im Sport eingesetzt wird. Der Einfluss von tsDCS auf das Nervensystem bleibt schlecht verstanden und die physiologischen Mechanismen hinter seinen Handlungen sind weitgehend unbekannt. Die gleichzeitige Anwendung des tsDCS mit intrazellulären Aufnahmen ermöglicht es uns, Veränderungen der Motoneuronmembraneigenschaften und Eigenschaften des rhythmischen Abfeuerns als Reaktion auf die Polarisation des spinalen neuronalen Netzwerks, die für das Verständnis von tsDCS-Aktionen entscheidend ist, direkt zu beobachten. Darüber hinaus bietet das vorgestellte Protokoll, wenn es die Identifizierung des Motoneurons in Bezug auf einen innervierten Muskel und seine Funktion (Flexor versus Extensor) sowie den physiologischen Typ (schnell versus langsam) umfasst, die Möglichkeit, den Einfluss von tsDCS auf identifizierte Komponenten der Wirbelsäulenschaltung, die von der Polarisation unterschiedlich beeinflusst zu sein scheinen, selektiv zu untersuchen. Das vorgestellte Verfahren konzentriert sich auf die chirurgische Vorbereitung auf intrazelluläre Aufnahmen und Stimulation mit Einem Schwerpunkt auf den Schritten, die notwendig sind, um Präparationsstabilität und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu erreichen. Die Einzelheiten der Methodik der anodalen oder kathhodalen tsDCS-Anwendung werden unter Berücksichtigung praktischer und sicherheitsgewisser informationen erörtert.
Introduction
Transspinale Gleichstromstimulation (tsDCS) erhält Anerkennung als eine potente Methode zur Veränderung der Erregbarkeit des Spinalkreislaufs bei Gesundheit und Krankheit1,2,3. Bei dieser Technik wird ein konstanter Strom zwischen einer aktiven Elektrode über ausgewählten Wirbelsäulensegmenten übergeben, wobei eine Referenzelektrode entweder ventral oder rostral4befindet. Mehrere Studien haben bereits bestätigt, dass tsDCS bei der Verwaltung bestimmter pathologischer Erkrankungen wie neuropathische Schmerzen5, Spastik6, Rückenmarksverletzung7 oder zur Erleichterung der Rehabilitation8. Die Forscher vermuten, dass tsDCS Veränderungen in der Ionenverteilung zwischen dem intrazellulären und dem extrazellulären Raum über die Zellmembran hervorruft, und dies kann entweder die neuronale Aktivität je nach aktueller Ausrichtung9,10,11erleichtern oder hemmen. Bis vor kurzem fehlte jedoch eine direkte Bestätigung dieses Einflusses auf Motoneuronen.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur In-vivo-intrazellulären Aufzeichnung elektrischer Potentiale aus Lendenwirbelsäulen-Motoneuronen bei der anästhesierten Ratte bei gleichzeitiger Anwendung von tsDCS, um Veränderungen der Motoneuronmembran und feuerende Eigenschaften als Reaktion auf die anodale oder katahodale Polarisation des spinalen neuronalen Netzwerks zu beobachten. Intrazelluläre Aufnahmen öffnen mehrere Bereiche der Untersuchung von Neuroneneigenschaften, nicht verfügbar für zuvor verwendete extrazelluläre Techniken9,12. Beispielsweise ist es möglich, die Motoneuron-Membranspannung auf den durch tsDCS induzierten Gleichstromfluss präzise zu messen, die Spannungsschwelle für die Spitzenerzeugung anzugeben oder Aktionspotenzialparameter zu analysieren. Darüber hinaus ermöglicht uns diese Technik, passive Membraneigenschaften von Motoneuron zu bestimmen, wie z. B. Eingangswiderstand, und den Zusammenhang zwischen intrazellulärem Stimulationsstrom und Häufigkeit des rhythmischen Abfeuerns von Motoneuronen zu beobachten. Die antidromische Identifizierung von aufgezeichnetem Motoneuron, basierend auf der Stimulation funktionell identifizierter Nerven (d.h. Nerven, die Flexoren oder Extensoren efferents liefern) ermöglicht es uns, zusätzlich Typen von innervierten Motoreinheiten (schnell versus langsam) zu identifizieren, was die Möglichkeit gibt zu testen, ob polarisation steile debeeinflusst einzelne Elemente des reifen spinalen neuronalen Systems. Aufgrund umfangreicher Operationen vor der Aufnahme und hohen Anforderungen an die Stabilität und Zuverlässigkeit von Aufnahmen ist diese Technik sehr anspruchsvoll, ermöglicht aber eine direkte und langfristige Beurteilung der elektrophysiologischen Eigenschaften eines Motoneurons: vor, während und nach der Anwendung von tsDCS, was entscheidend ist, um sowohl seine akute Wirkung als auch die anhaltende Wirkung zu bestimmen13. Als Motoneuron aktiviert direkt extrafusale Muskelfasern14 und nimmt an der Rückkopplungssteuerung einer Muskelkontraktion und entwickelter Kraft15teil,16 jeder beobachtete Einfluss von tsDCS auf die Motoreinheit oder Muskelkontraktilen Eigenschaften kann mit Modulationen der Motoneuron Erregbarkeit oder Feuereigenschaften verbunden werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bei korrekter Durchgeführtkeit sollte der chirurgische Teil des beschriebenen Protokolls innerhalb von etwa drei Stunden abgeschlossen sein. Besonders vorsichtig ist es, während der Operation stabile physiologische Bedingungen eines Tieres, insbesondere körperintheischer Temperatur und Tiefe der Anästhesie, aufrechtzuerhalten. Abgesehen von offensichtlichen ethischen Erwägungen kann ein Mangel an richtiger Anästhesie zu übermäßigen Gliedmaßenbewegungen während der Nervensektion oder Laminektomie führen und zu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Stipendium des National Science Center Nr. 2017/25/B/NZ7/00373 unterstützt. Die Autoren möchten die Arbeit von Hanna Drzymaa-Celichowska und W.zimierz Mr. wczyéski würdigen, die beide zur Datenerhebung und Analyse der in diesem Beitrag vorgestellten Ergebnisse beigetragen haben.
Materials
| Durgs and solutions | – | – | – |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | – | – |
| Glucose | Merck | 346351 | – |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | – |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | – | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Puławy Sp. z o.o | – | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | – |
| Tetraspan | Braun | – | HES solution |
| Surgical equipment | – | – | – |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | – |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | – |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | – |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | – | – | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | – |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | – |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | – | – | – |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | – |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | – |
| Equipment | – | – | – |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | – | – | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | – | – | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | – | – | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | – | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | – | – | – |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | – | – | – |
| flexible tubing | – | – | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | – | – | For nerve electrodes |
References
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