En Vivo Registro Intracelular de Motoneurones Espinales de Rata Tipo Identificados Durante estimulación de corriente directa trans-espinal
Summary
Este protocolo describe el registro intracelular in vivo de motoneurones lumbares de rata con estimulación simultánea de corriente directa trans-espinal. El método nos permite medir las propiedades de la membrana y registrar la cocción rítmica de motoneurones antes, durante y después de la polarización anodal o catódal de la médula espinal.
Abstract
El registro intracelular de motoneurones espinales in vivo proporciona un “estándar de oro” para determinar las características electrofisiológicas de las células en la red espinal intacta y posee ventajas significativas en relación con las técnicas clásicas de registro in vitro o extracelular. Una ventaja de las grabaciones intracelulares in vivo es que este método se puede realizar en animales adultos con un sistema nervioso completamente maduro, y por lo tanto muchos mecanismos fisiológicos observados se pueden traducir a aplicaciones prácticas. En este documento metodológico, describimos este procedimiento combinado con la estimulación de corriente constante aplicada externamente, que imita los procesos de polarización que ocurren dentro de las redes neuronales espinales. La estimulación de corriente directa trans-espinal (tsDCS) es un método innovador cada vez más utilizado como una intervención neuromoduladora en la rehabilitación después de diversas lesiones neurológicas, así como en deportes. La influencia de tsDCS en el sistema nervioso sigue siendo mal entendida y los mecanismos fisiológicos detrás de sus acciones son en gran parte desconocidos. La aplicación del tsDCS simultáneamente con grabaciones intracelulares nos permite observar directamente los cambios de las propiedades de la membrana del motoneurón y las características de la cocción rítmica en respuesta a la polarización de la red neuronal espinal, que es crucial para la comprensión de las acciones tsDCS. Por otra parte, cuando el protocolo presentado incluye la identificación del motoneuron con respecto a un músculo inervado y su función (flexor versus extensor) así como el tipo fisiológico (rápido versus lento) proporciona una oportunidad para investigar selectivamente la influencia de tsDCS en los componentes identificados del circuito espinal, que parecen verse afectados de manera diferente por la polarización. El procedimiento presentado se centra en la preparación quirúrgica para grabaciones intracelulares y estimulación con énfasis en los pasos que son necesarios para lograr la estabilidad de la preparación y la reproducibilidad de los resultados. Los detalles de la metodología de la aplicación anodal o cathodal tsDCS se discuten mientras se presta atención a cuestiones prácticas y de seguridad.
Introduction
La estimulación de corriente directa trans-espinal (tsDCS) está ganando reconocimiento como un método potente para modificar la excitabilidad del circuito espinal en la salud y la enfermedad1,2,3. En esta técnica, se pasa una corriente constante entre un electrodo activo situado por encima de los segmentos espinales seleccionados, con un electrodo de referencia situado ventralmente o más rostralmente4. Varios estudios ya han confirmado que el tsDCS se puede utilizar en el manejo de ciertas condiciones patológicas, como el dolor neuropático5,la espasticidad6,la lesión de la médula espinal7 o para facilitar la rehabilitación8. Los investigadores sugieren que tsDCS evoca alteraciones en la distribución iónica entre el espacio intracelular y el espacio extracelular a través de la membrana celular, y esto puede facilitar o inhibir la actividad neuronal dependiendo de la orientación actual9,10,11. Sin embargo, hasta hace poco, faltaba una confirmación directa de esta influencia en las motoneurones.
Aquí, describimos un protocolo detallado para llevar a cabo el registro intracelular in vivo de potenciales eléctricos de motoneurones espinales lumbares en la rata anestesiada con aplicación simultánea de tsDCS, con el fin de observar cambios en la membrana de motoneuron y propiedades de disparo en respuesta a la polarización anodal o cathodal de la red neuronal espinal. Las grabaciones intracelulares abren varias áreas de investigación de las propiedades de las neuronas, no disponibles para las técnicas extracelulares utilizadas anteriormente9,,12. Por ejemplo, es posible medir con precisión la respuesta de voltaje de membrana de motoneuron al flujo de corriente directa inducido por tsDCS, indicar el umbral de voltaje para la generación de picos, o analizar los parámetros potenciales de acción. Además, esta técnica nos permite determinar las propiedades de la membrana pasiva del motoneurón, como la resistencia a la entrada, y observar la relación entre la corriente de estimulación intracelular y la frecuencia de cocción rítmica de motoneurones. La identificación antidrómica del motoneurón registrado, basada en la estimulación de los nervios identificados funcionalmente (es decir, los nervios que proporcionan aferentes a flexores o extensores) nos permite identificar adicionalmente tipos de unidades motoras inervadas (rápidas frente a lentas), lo que da la oportunidad de probar si la polarización influye de manera diferente en los elementos individuales del sistema neuronal espinal maduro. Debido a la extensa cirugía anterior al registro y a los altos requisitos de estabilidad y fiabilidad de las grabaciones, esta técnica es muy difícil, pero permite una evaluación directa y a largo plazo de las características electrofisiológicas de un motoneuron: antes, durante y después de la aplicación de tsDCS, lo que es crucial para determinar tanto sus acciones agudas como los efectos persistentes13. Como un motoneuron activa directamente las fibras musculares extrafusales14 y participa en el control de retroalimentación de una contracción muscular y fuerza desarrollada15,16 cualquier influencia observada de tsDCS en la unidad motora o propiedades contráctiles musculares pueden estar vinculadas a modulaciones de excitabilidad de motoneuron o características de disparo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Si se realiza correctamente, la parte quirúrgica del protocolo descrito debe completarse en un plazo aproximado de tres horas. Uno debe tener especial cuidado en mantener condiciones fisiológicas estables de un animal durante la cirugía, en particular la temperatura corporal y la profundidad de la anestesia. Aparte de consideraciones éticas obvias, la falta de anestesia adecuada puede resultar en movimientos excesivos de las extremidades durante la disección nerviosa o laminectomía y conducir a daños en la prepara…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención No 2017/25/B/NZ7/00373 del Centro Nacional de Ciencias. A los autores les gustaría reconocer el trabajo de Hanna Drzyma-a-Celichowska y W-odzimierz Mrówczy-ski, quienes contribuyeron a la recopilación de datos y al análisis de los resultados presentados en este documento.
Materials
| Durgs and solutions | – | – | – |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | – | – |
| Glucose | Merck | 346351 | – |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | – |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | – | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Puławy Sp. z o.o | – | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | – |
| Tetraspan | Braun | – | HES solution |
| Surgical equipment | – | – | – |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | – |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | – |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | – |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | – | – | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | – |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | – |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | – | – | – |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | – |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | – |
| Equipment | – | – | – |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | – | – | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | – | – | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | – | – | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | – | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | – | – | – |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | – | – | – |
| flexible tubing | – | – | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | – | – | For nerve electrodes |
References
- Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).
- Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance. PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).
- Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level. Neurosciences. 393, 150-163 (2018).
- Parazzini, M., et al. Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS). Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).
- Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury. Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).
- Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects. The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).
- de Araújo, A. V. L., et al. Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis. Spinal Cord. , (2020).
- de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).
- Ahmed, Z. Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity. Physiological Reports. 4 (3), (2016).
- Bolzoni, F., Jankowska, E. Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations. The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).
- Cogiamanian, F., et al. Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation. Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).
- Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat. The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system’s final pathway. Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).
- Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior. Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).
- Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions. Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).
- Gardiner, P. F. Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms. Physiological Reports. 2 (9), (2014).
- Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).
- Bączyk, M., Jankowska, E. Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats. Journal of Applied Physiology. 126 (5), 1232-1241 (2019).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats. European Journal of Neuroscience. , (2019).
- Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. The Journal of Physiology. 557, 175-190 (2004).
- Jankowska, E. Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).
- Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones. The Journal of Physiology. 573, 663-677 (2006).
