In Vivo Registrazione intracellulare di Motoneuroni Spinali Ratti Identificati dal Tipo durante la stimolazione a corrente diretta trans-spinale
Summary
Questo protocollo descrive la registrazione intracellulare in vivo dei motoneuroni lombari con stimolazione simultanea della corrente diretta trans-spinale. Il metodo ci permette di misurare le proprietà della membrana e di registrare la cottura ritmica dei motoneuroni prima, durante e dopo la polarizzazione anodale o tadale del midollo spinale.
Abstract
La registrazione intracellulare dei motoneuroni spinali in vivo fornisce uno “standard d’oro” per determinare le caratteristiche elettrofisiologiche delle cellule nella rete spinale intatta e contiene vantaggi significativi rispetto alle tecniche classiche di registrazione in vitro o extracellulare. Un vantaggio delle registrazioni intracellulari in vivo è che questo metodo può essere eseguito su animali adulti con un sistema nervoso completamente maturo, e quindi molti meccanismi fisiologici osservati possono essere tradotti in applicazioni pratiche. In questo documento metodologico, descriviamo questa procedura combinata con la stimolazione a corrente costante applicata esternamente, che imita i processi di polarizzazione che si verificano all’interno delle reti neuronali spinali. La stimolazione trans-spinale a corrente diretta (tsDCS) è un metodo innovativo sempre più utilizzato come intervento neuromodulatore nella riabilitazione dopo varie lesioni neurologiche e nello sport. L’influenza di tsDCS sul sistema nervoso rimane poco compresa e i meccanismi fisiologici dietro le sue azioni sono in gran parte sconosciuti. L’applicazione del tsDCS contemporaneamente alle registrazioni intracellulari ci permette di osservare direttamente i cambiamenti delle proprietà della membrana del motoneurone e le caratteristiche della cottura ritmica in risposta alla polarizzazione della rete neuronale spinale, che è fondamentale per la comprensione delle azioni tsDCS. Inoltre, quando il protocollo presentato include l’identificazione del motoneurone rispetto a un muscolo innervato e la sua funzione (flessore contro estensore) così come il tipo fisiologico (veloce contro lento) offre l’opportunità di indagare selettivamente l’influenza del tsDCS sui componenti identificati dei circuiti spinali, che sembrano essere influenzati in modo diverso dalla polarizzazione. La procedura presentata si concentra sulla preparazione chirurgica per le registrazioni intracellulari e la stimolazione con un’enfasi sui passi necessari per ottenere la stabilità di preparazione e la riproducibilità dei risultati. I dettagli della metodologia dell’applicazione tsDCS anodale o catodale sono discussi prestando attenzione alle questioni pratiche e di sicurezza.
Introduction
La stimolazione a corrente diretta trans spinale (tsDCS) sta guadagnando riconoscimento come metodo potente per modificare l’eccitabilità del circuito spinale in salute emalattia 1,2,3. In questa tecnica, una corrente costante viene passata tra un elettrodo attivo situato sopra i segmenti spinali selezionati, con un elettrodo di riferimento situato sia ventralemente che più rostralmente4. Diversi studi hanno già confermato che il tsDCS può essere utilizzato nella gestione di determinate condizioni patologiche, come il doloreneuropatico 5, la spasticità6, la lesione del midollospinale 7 o per facilitare la riabilitazione8. I ricercatori suggeriscono che il tsDCS evoca alterazioni nella distribuzione degli ioni tra lo spazio intracellulare e lo spazio extracellulare attraverso la membrana cellulare, e questo può facilitare o inibire l’attività neuronale a secondadell’orientamento corrente 9,10,11. Tuttavia, fino a poco tempo fa, mancava una conferma diretta di questa influenza sui motoneuroni.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per condurre in vivo la registrazione intracellulare dei potenziali elettrici dai motoneuroni lombari spinali nel ratto anethetizzato con applicazione simultanea di tsDCS, al fine di osservare i cambiamenti nella membrana motoneurone e le proprietà di cottura in risposta alla polarizzazione anodale o cathodale della rete neuronale spinale. Le registrazioni intracellulari aprono diverse aree di indagine delle proprietà dei neuroni, non disponibili per le tecniche extracellulari utilizzate inprecedenza 9,12. Ad esempio, è possibile misurare con precisione la risposta di tensione della membrana del motoneurone al flusso di corrente diretta indotto da tsDCS, indicare la soglia di tensione per la generazione di picchi o analizzare i potenziali parametri di azione. Inoltre, questa tecnica ci permette di determinare le proprietà della membrana passiva del motoneurone, come la resistenza all’ingresso, e di osservare la relazione tra la corrente di stimolazione intracellulare e la frequenza di cottura ritmica dei motoneuroni. L’identificazione antidromica del motoneurone registrato, basata sulla stimolazione dei nervi identificati dal punto di vista funzionale (cioè i nervi che forniscono efferenti ai flessori o agli estensori) ci permette di identificare inoltre i tipi di unità motorie innervate (veloce o lento), il che offre l’opportunità di verificare se la polarizzazione influenza in modo diverso i singoli elementi del sistema neuronale spinale maturo. A causa di un’estesa chirurgia che precede la registrazione e di elevati requisiti di stabilità e affidabilità delle registrazioni, questa tecnica è altamente impegnativa ma consente una valutazione diretta e a lungo termine delle caratteristiche elettrofisiologiche di un motoneurone: prima, durante e dopo l’applicazione di tsDCS, che è fondamentale per determinare sia le sue azioni acute che gli effetti persistenti13. Come un motoneuron attiva direttamente le fibre muscolari extrafuso14 e prende parte al controllo di feedback di una contrazione muscolare e sviluppato forza15,16 qualsiasi influenza osservata di tsDCS sull’unità motoria o le proprietà contraili muscolari possono essere collegati a modulazioni di motoneurone eccitabilità o caratteristiche di cottura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se eseguita correttamente, la parte chirurgica del protocollo descritto deve essere completata entro circa tre ore. Si dovrebbe fare particolare attenzione nel mantenere condizioni fisiologiche stabili di un animale durante l’intervento chirurgico, in particolare la temperatura corporea e la profondità dell’anestesia. A parte ovvie considerazioni etiche, la mancanza di un’anestesia adeguata può provocare eccessivi movimenti degli arti durante la dissezione nervosa o la laminectomia e portare a danni alla preparazione o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del National Science Center n. 2017/25/B/N/7/00373. Gli autori vorrebbero riconoscere il lavoro di Hanna Drzymaa-Celichowska e W’odzimierz Mr’cwczy’ski, che hanno entrambi contribuito alla raccolta e all’analisi dei risultati presentati in questo documento.
Materials
| Durgs and solutions | – | – | – |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | – | – |
| Glucose | Merck | 346351 | – |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | – |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | – | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Puławy Sp. z o.o | – | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | – |
| Tetraspan | Braun | – | HES solution |
| Surgical equipment | – | – | – |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | – |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | – |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | – |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | – | – | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | – |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | – |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | – | – | – |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | – |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | – |
| Equipment | – | – | – |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | – | – | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | – | – | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | – | – | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | – | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | – | – | – |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | – | – | – |
| flexible tubing | – | – | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | – | – | For nerve electrodes |
References
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