Summary
Описана процедура дифференцировки in vitro эмбриональных стволовых клеток мышей в нейрональные клетки методом висячей капли. Кроме того, мы проводим комплексный фенотипический анализ с помощью RT-qPCR, иммунофлуоресценции, РНК-seq и проточной цитометрии.
Abstract
Мы описываем пошаговую процедуру культивирования и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши в нейронные линии, за которой следует серия анализов для характеристики дифференцированных клеток. Эмбриональные стволовые клетки мыши E14 использовались для формирования эмбриональных тел с помощью метода висячей капли, а затем индуцировались для дифференцировки в нейронные клетки-предшественники ретиноевой кислотой и, наконец, дифференцировались в нейроны. Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-qPCR) и эксперименты с иммунофлуоресценцией показали, что нейронные предшественники и нейроны демонстрируют соответствующие маркеры (нестин для нейронных предшественников и нейрофиламент для нейронов) на 8 и 12 день после дифференцировки соответственно. Эксперименты по проточной цитометрии на линии E14, экспрессирующей репортер GFP, управляемый промотором Sox1, показали, что около 60% клеток на 8-й день являются положительными GFP, что указывает на успешную дифференцировку нейронных клеток-предшественников на этом этапе. Наконец, анализ RNA-seq был использован для профилирования глобальных транскриптомных изменений. Эти методы полезны для анализа участия конкретных генов и путей в регулировании перехода клеточной идентичности во время дифференцировки нейронов.
Introduction
С момента их первого получения из внутренней клеточной массы развивающихся бластоцист мыши1,2,эмбриональные стволовые клетки мыши (mESC) использовались в качестве мощных инструментов для изучения самообновления и дифференцировки стволовых клеток3. Кроме того, изучение дифференциации mESC приводит к огромному пониманию молекулярных механизмов, которые могут повысить эффективность и безопасность терапии на основе стволовых клеток при лечении таких заболеваний, как нейродегенеративные расстройства4. По сравнению с животными моделями, эта система in vitro обеспечивает множество преимуществ, включая простоту в практике и оценке, низкую стоимость в поддержании клеточных линий в отличие от животных и относительную легкость в генетических манипуляциях. Однако на эффективность и качество дифференцированных типов клеток часто влияют различные линии мЭСК, а также методы дифференцировки5,6. Кроме того, традиционные анализы для оценки эффективности дифференцировки основаны на качественном исследовании выбранных маркерных генов, которым не хватает надежности, и поэтому они не могут понять глобальные изменения в экспрессии генов.
Здесь мы стремимся использовать батарею анализов для систематической оценки дифференцировки нейронов. Используя как традиционный анализ in vitro на выбранных маркерах, так и RNA-seq, мы создаем платформу для измерения эффективности дифференцировки, а также транскриптомных изменений во время этого процесса. Основываясь на ранее установленном протоколе7,мы генерировали эмбриоидные тела (ЭБ) с помощью метода висячей капли с последующей индукцией с использованием супрафизиологического количества ретиноевой кислоты (РА) для генерации нейронных клеток-предшественников (NPC), которые впоследствии были дифференцированы в нейроны с нейронной индукционной средой. Чтобы изучить эффективность дифференцировки, в дополнение к традиционным анализам RT-qPCR и иммунофлуоресценции (IF), мы выполнили РНК-seq и проточную цитометрию. Эти анализы обеспечивают всестороннее измерение прогрессии дифференцировки по специфической стадии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура mESC
- Покрыть 10-сантиметровую пластину, обработанную культурой ткани, 0,1% желатина и дать желатину схватиться в течение не менее 15–30 минут, прежде чем аспирировать его.
- Семена γ облученные мыши эмбриональные фибробласты (MEF) за один день до культивирования mESCs в предварительно подогретой среде mESC (модифицированная среда Dulbecco Eagle (DMEM) с 15% фетальной бычьей сывороткой (FBS), заменимыми аминокислотами, β-меркаптоэтанолом, L-глутамином, пенициллином / стрептомицином, пируватом натрия, LIF, PD0325901 (PD) и Chir99021 (CH)).
- Позвольте облученным γ MEF осесть и прикрепиться к поверхности пластины перед культивированием клеток E14.
- Разморозьте E14 ESCs на водяной бане 37 °C и быстро переложите ячейки в коническую трубку 15 см с теплой средой mESC. Гранулируют ячейки по 200 х г в течение 3 мин и удаляют надосадочную массу.
- Повторно суспендируйте клетки в 10 мл среды mESC и нанесите клетки на культуральную пластину, содержащую γ облученные MEF, посеянные ранее. Инкубируйте культуру клеток в инкубаторе с температурой 37 °C при 5% CO2.
- Для прохождения культуры аспирируйте е среду и промывайте пластину стерильным 1x PBS. Добавьте достаточное количество 0,05% трипсина для покрытия поверхности пластины и инкубируйте при 37 °C в течение 3 мин.
- Нейтрализуйте трипсин средой mESC и пипеткой для получения одноклеточной суспензии. Центрифугируют ячейки при 200 х г в течение 3 мин и удаляют супернатант.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток и посейте около 5,0 х 105 клеток в 10 см культуральную пластину.
- Повторно суспендируют клетки в 10 мл среды mESC, наносят клетки на покрытую желатином тканевую культуральную пластину и инкубируют культуры, как описано ранее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы mESC проходили каждые 2 дня, чтобы предотвратить дифференцировку клеток в своих колониях. Фенол красный в среде функционирует исключительно как показатель рН и в зависимости от клеточной плотности может стать желтоватым (более кислым), раньше, чем через 2 дня. Следовательно, может потребоваться менять среду каждый день. Облученные γ MEF в конечном итоге вымрут через пару проходов.
2. Дифференцировка EB, NPC и нейронов
- Выполните протокол пропуска культуры, упомянутый ранее, и подсчитайте клетки (шаги 1.7–1.10).
- Метод подвешивания капель (день 0)
- Для 10-сантиметровой клеточной культуральной пластины считайте примерно 2,5 х10 4 клетки, где 5,0х 10 2 клетки будут суспендированы в 20-мкл дифференцировочной среде (DMEM с 15% FBS, заменимыми аминокислотами, β-меркаптоэтанолом, L-глутамином, пенициллином / стрептомицином и пируватом натрия). Примерно пятьдесят капель по 20 мкл, содержащих клетки, могут быть покрыты одной пластиной размером 10 см.
- Аликвотирует соответствующее количество клеток, а затем центрифугирует ячейки при 200 х г в течение 3 мин и удаляет надосадочный агент.
- Повторно суспендировать клетки в соответствующем объеме дифференцировочной среды для плотности клеток 5,0х 10 2 клеток на 20 мкл (например, 2,5 х 104 клетки в 1 мл дифференцировочной среды).
- Используя микропипетку или пипетку-ретранслятор, поместите 20 мкл капель клеточной суспензии на крышку тканевой культуральной пластины. Убедитесь, что капли не находятся слишком близко друг к другу, чтобы предотвратить их слияние.
ПРИМЕЧАНИЕ: Капли могут быть покрыты либо обработанной тканью крепежной пластиной, либо суспензионной пластиной, поскольку они будут помещены на крышку, а не на саму пластину. Для более осуществимого и стерильного подхода наносите капли на пластину присоединения ткани-культуры и переносите их на суспензионную пластину, как описано ниже. - Заполните пластину 5–10 мл 1x PBS и аккуратно положите крышку обратно на тарелку. Инкубируйте культуру в инкубаторе при температуре 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: PBS добавляют в культуральную пластину, чтобы предотвратить высыхание капель.
- На 2-й деньиспользуйте микропипетку, чтобы собрать капли с крышки и поместить их в 10-сантиметровую суспензионную пластину клеточной культуры, заполненную 10 мл дифференцировочной среды. Инкубируют культуру на орбитальном шейкере, трясущемся на низкой скорости в инкубаторе.
- На 4 день,чтобы собрать ЭБ, собрать клетки, центрифугировать при 200 х г в течение 3 мин и удалить супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: ЭБ также могут быть промыты 1x PBS в соответствии с требованиями последующих экспериментов. - Чтобы продолжить процедуру и индуцировать дифференцировку ЭБ в нейронные клетки-предшественники (NPC), готовят среду дифференцировки с 5 мкМ ретиноевой кислоты (РА).
- Удалите старую среду, гранулируя ЭБ при 100 х г в течение 3 мин или дайте ЭБ осесть перед аспирацией старой среды. Добавьте 10 мл дифференцировочной среды, содержащей 5 мкМ РА, к культуральной пластине.
- На 6-й деньзамените по меньшей мере половину среды свежей средой, содержащей 5 мкМ РА, наклонив пластину и выпустив среду, как описано выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы по крайней мере половина среды была заменена свежей средой, содержащей РА, в дни 5 и 7. Обратите внимание на индикатор фенольного красного цвета; если он становится желтоватым, лучше всего заменить всю среду. - На 8-й деньсобирают NPC, собирая клетки, центрифугируя при 200 х г в течение 3 минут и удаляя супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: NPC также могут быть промыты 1x PBS в соответствии с потребностями последующих экспериментов. При необходимости NPC могут быть заморожены и разморожены снова для последующей культуры и анализа. Если NPC должны быть культивированы, аккутаза также может быть использована в качестве альтернативы трипсину. - Чтобы продолжить процедуру и дифференцировать NPC в нейроны, собирают NPC в коническую трубку объемом 15 мл путем центрифугирования, диссоциируют их трипсином и инкубируют при 37 °C в течение 3 мин. Пипетка NPC для обеспечения того, чтобы все агрегаты NPC были диссоциированы и нейтрализовали трипсин средой.
- Фильтруйте клетки с помощью ситечка нейлоновых клеток 40 мкм и подсчитывайте клетки перед их покрытием при плотности 1,5 x 105/см2 в среде N2 (среда DMEM/F12 + 3 мг/мл глюкозы + 3 мг/мл богатого липидами бычьего сывороточного альбумина (LBSA) + добавка N2 1:100 N2 + 10 нг/мл bFGF + 50 Ед/мл ручки/стрептококка + 1 мМ L-глутамина) на обработанной культурой ткани пластине для последующих экспериментов с ПЦР и вестерн-блотом; или на камере культуры тканей для экспериментов с иммунофлуоресценцией.
- На 9-й деньзамените старую среду на свежую среду N2.
- На 10-й деньпереключите среду N2 на среду N2/B27 (50% DMEM/F12 и 50% нейронной базальной, 3 мг/мл LBA, добавка N2 1:200, добавка B27 1:100, ручка/стрептокк 50 Ед/мл и 1 мМ L-глутамина).
- В дни 11–12собирают нейроны следующим образом. Промыть клетки 1x PBS, добавить трипсин и инкубировать культуру в инкубаторе 37 °C в течение 3 мин перед нейтрализацией трипсина средой и центрифугой при 200 х г в течение 3 мин.
3. Характеристика мЭСК и дифференцированных клеток
- Анализ щелочной фосфатазы (AP)
- Используйте набор для оценки активности щелочной фосфатазы (см. Таблицу материалов).
- Снимите среду с тарелки для культивирования и промойте ЭСК 1x PBS.
- Добавить 1 мл фиксированного раствора (состоит из формальдегида и метанола), снабженного набором, к пластине и инкубировать его при комнатной температуре в течение 2–5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерная инкубация в решении fix может поставить под угрозу активность AP. - Удалите фиксирующий раствор, промойте ЭСК с 1x PBS и оставьте некоторое количество PBS в пластине.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите ESC влажными в PBS, чтобы не ставить под угрозу активность AP. - Готовят раствор АР путем смешивания растворов подложки А, В и С в соотношении 1:1:1. Сначала смешайте растворы А и В и инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 2 мин перед добавлением раствора С.
- Удалите 1x PBS и добавьте решение AP, подготовленное ранее.
- Инкубируйте ЭСК в течение примерно 15 минут в темноте, обернув культуральную пластину алюминиевой фольгой или выполнив этап 3,5 в темном помещении.
- Контролируйте реакцию и удаляйте реакционный раствор, когда раствор становится ярким, чтобы избежать неспецифического окрашивания.
- Дважды промывайте ESC с помощью 1x PBS.
- Предотвратите высыхание образца, покрыв ЭСК 1x PBS или монтажным материалом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Красное или фиолетовое пятно появится для выражения AP. Пластину можно хранить в холодильнике с температурой 4 °C.
- РТ-кПЦР
- Собирайте клетки на различных стадиях, выполняя шаги 1,6–1,7 и 2,4 для ЭСК и ЭБ и NPC соответственно.
- Изолируйте РНК с помощью РНК, ДНК и раствора для экстракции белка (см. Таблицу материалов).
- Генерируйте кДНК с помощью набора обратной транскриптазы (см. Таблицу материалов)и следуйте руководству производителя.
- Фиксация и встраивание
- Соберите ЭБ и NPC, как описано выше (этап 2.6), и зафиксируйте их 4% раствором параформальдегида (PFA) в 1x PBS в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Извлеките PFA и промывайте образец 1x PBS в течение 5 минут.
- Поместите образец в последовательное разведение 1x PBS, 10%-, 20%- и 30%-сахарозных растворов при 25\u201228 °C, где образец переносят в следующий раствор после 30 мин инкубации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец можно хранить в 30% растворе сахарозы при 4 °C, прежде чем продолжить этап встраивания. - Смочите наконечник пипетки раствором сахарозы перед помещением образца (без укладки) в центр криоформы и выделите излишки жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтровальная бумага также может быть использована для удаления лишнего раствора. Смачивание наконечника пипетки раствором сахарозы важно для предотвращения прилипания ЭБ и NPC к стенкам наконечника. - Осторожно добавьте в форму раствор оптимальной температуры резания (OCT) без повторного использования образцов и удалите лишние пузырьки пипеткой.
- Поместите форму с образцом на лабораторный смеситель на низкой скорости, чтобы слегка перемешать образец в течение 15 минут. Это помогает расположить ЭБ и NPC внизу, если они повторно суспендированы в решении центра развертывания Office.
- Быстро заморозьте образец, поместив форму в жидкий азот или на сухой лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить в морозильной камере при температуре -70 °C, прежде чем перейти к следующему шагу.
- Криосекционирование
- Установите криостат на охлаждение до -20-18 °C перед передачей образца на прибор.
- Отсоедините замороженный блок OCT от формы и закрепите его на держателе с помощью небольшого раствора OCT, размещенного на поверхности держателя.
- Выровняйте блок центра развертывания Office таким образом, чтобы EB и NPC находились ближе всего к колонке, чтобы образец не был потерян во время секционирования.
- Тщательно разделите 10 мкм блока и обратите пристальное внимание на срезы, которые содержат образец.
- Быстро поместите срез OCT, содержащий образец, на стеклянный слайд для встраивания в ткань и дайте ломтикам OCT высохнуть на воздухе в течение 1 ч при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться при температуре -70 °C для последующего использования.
- Иммунофлуоресценция (ИФ)
- Блокируйте секции OCT или культуральные камеры, содержащие нейроны в 10% нормальной ослиной сыворотке /0,1% Triton X-100 в 1x PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Инкубируйте образцы в первичном антителе, разведенном в 5% нормальной ослиной сыворотке / 0,05% Triton X-100 в 1x PBS на ночь при 4 °C.
- Промывайте образцы в 1x PBS/0,1% Triton X-100 трижды в течение 5 мин каждую стирку.
- Инкубируют образцы с вторичными антителами, разведенными в 5% нормальной ослиной сыворотке/0,05% Тритоне Х-100 в 1x PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Промывайте образцы в 1x PBS/0,1% Triton X-100 трижды в течение 5 мин каждую промывку, затем инкубируйте образцы в 1 мкг/мл DAPI.
- Установите образцы с помощью крышки и некоторого монтажного носителя и дайте ему высохнуть.
- Наблюдайте за образцами под флуоресцентным микроскопом.
- Анализ РНК-сек
- Соберите клетки на различных стадиях и выполните извлечение РНК (см. шаг 3.2).
- Подготовьте библиотеки кДНК, выполните глубокое секвенирование и анализ данных по протоколу, описанному в Wang et al.8.
- Выполните анализ генной онтологии (GO) с помощью пакета R, clusterProfiler.
- Проточная цитометрия
- Соберите ЭСК, выполнив шаги 1.6–1.7, и повторно суспендируйте клетки в среде. Соберите ЭБ и NPC, выполнив шаг 2.4, и повторно суспендируйте ячейки в среде.
- Фильтруйте клеточную суспензию с помощью ситечка нейлоновых клеток 40 мкм в новую коническую трубку объемом 15 мл.
- Измерьте сигнал GFP образцов с помощью проточного цитометра (выполняемого основной установкой учреждения).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В качестве представления нашего метода мы провели эксперимент по дифференцировке EB, NPC и нейронов на клетках E14. Клетки E14 культивировали на γ облученных MEF(рисунок 1A)до тех пор, пока облученная γ популяция MEF не была разбавлена. Мы подтвердили плюрипотентность клеток E14, выполнив окрашивание щелочной фосфатазой (AP)(рисунок 1B),а затем RT-qPCR (см. Ниже) для маркеров Nanog и Oct4. Затем γ облученные клетки E14 без MEF были индуцированы для дифференцировки с использованием протокола, описанного на рисунке 2A. Вкратце, капли дифференцировочной среды объемом 20 мкл, содержащие 500 клеток, были посеяны на крышке культуральной пластины (подробности см. в разделе протокола 2). Сформированные ЭБ затем собирали и помещали в суспензию в свежие дифференцирующие среды. С 4 по 8 день дифференцировки к культуральным пластинам добавляли 5 мкМ РА для индуцирования NPC. Дифференцированные ЭБ показали круглую форму и их размер продолжал увеличиваться во время дифференцировки(рисунок 2B). На 8-й день NPC собирали и трипсинизировали, а затем полученную одноклеточную суспензию покрывали в камере культуры тканей в среде DMEM /F12 с добавкой N2, а затем в добавке B27. К 10-му дню NPC, дифференцирующиеся в нейроны, по-видимому, имеют форму удлиненной клетки(рисунок 2B).
Для дальнейшей оценки нашего эксперимента по дифференцировке мы провели эксперименты иммунофлуоресценции (IF) на NPC E14 на 8-й день и нейронах E14 на 12-й день. Мы наблюдали положительное окрашивание для нестина в NPC и сигнал нейрофиламента (NF) для нейронов(рисунок 3A). Альтернативно, RT-qPCR и RNA-seq подтвердили индукцию генов маркеров NPC и потерю генов плюрипотентности у NPC(Рисунок 3B,D,F). В качестве количественного метода для проверки успешности дифференциации ESC мы дифференцировали линию ESC мыши, выражающую управляемый промотором репортер9 Sox1, с последующим анализом проточной цитометрии на ESC и NPC. Мы обнаружили, что 58,7% от общего числа клеток на стадии NPC являются GFP-положительными, в то время как сигнал GFP составляет 0,0% на стадии ESC(рисунок 3C). Для профилирования транскриптомных изменений во время дифференцировки были проведены эксперименты RNA-seq для E14 ESCs, EB day 3 и NPC day 8 и выявлены кластеры генов, связанные с соответствующими стадиями(рисунок 3D). Гены на тепловой карте RNA-seq были отсортированы на основе их уровней экспрессии для идентификации дифференциально экспрессированных генов на разных стадиях во время дифференцировки. Анализ генной онтологии (GO) для четырех кластеров генов показал, что эти кластеры соответствуют различным клеточным функциям или путям, что указывает на то, что три клеточные стадии нейрональной дифференцировки mESC имеют группу генов, которые высоко экспрессируются на соответствующей стадии, но не другие(рисунок 3E). Например, гены в кластере 3 высоко экспрессируются у NPC E14 по сравнению с другими стадиями и соответствуют путям, связанным с развитием нейронов. Кластеры 1, 2 и 4 не содержат высоко экспрессированных генов, связанных с какими-либо спецификациями линии зародышевого слоя, но они связаны с клеточным ростом и пролиферацией. Таким образом, РНК-seq и сопутствующий анализ GO показали, что клетки E14 дифференцировались в нейронную линию к 8-му дню дифференцировки.
Рисунок 1: E14 ESC в культуре. Изображениясветовогомикроскопа показывают клетки E14 (черная стрелка), растущие колониями поверх γ облученных MEF. Колонии E14 продолжают размножаться, как видно из разницы в размерах колоний между культурами 1-го и 3-го дня. (B)Подтверждение плюрипотентности E14 ESC щелочной фосфатазой (AP) пятном. Фиолетовые стрелки указывают на mESCs, которые были положительными для пятна AP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Дифференциация E14 на ЭБ, NPC и нейроны. (A) Схема суммирует основные шаги по дифференцировке клеток E14 в EB, NPC и нейроны. (B)E14 ESC, культивируемые в среде без LIF и 2i в суспензионной пластине, образуют отдельные сферы ЭБ, видимые на дне 2, где они продолжают расти и расширяться в размерах в последующие дни. РА добавляют на 4 день дифференциации, чтобы индуцировать дифференциацию в NPC. После 4 дней индукции эти NPC покрываются для дифференцировки в нейроны, которые показаны на нижней панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Характеристика дифференцированных клеток. (A)Иммунофлуоресцентные изображения на верхней панели показывают NPC-содержащие ЭБ на 8-й день, исследуемые на наличие нестина (зеленый) и ядер (DAPI, синий). Нижняя панель показывает иммунофлуоресцентные изображения для нейронов на 12-й день, исследованных на нейрофиламент (зеленый). Красная рамка в объединенных изображениях увеличена в 3 раза для лучшего обзора. (B)Анализ RT-qPCR, показывающий маркеры плюрипотентности (Nanog и Oct4) и маркеры NPC (Pax6, NeuroD1и Nes) E14 ESC и NPC. Полосы ошибок являются средними ± SD.(C)Клетки E14, экспрессирующие управляемый промотором репортер Sox1 GFP, были дифференцированы в NPC. Как ЭСК, так и NPC на 8-й день были количественно определены для положительного флуоресцентного сигнала GFP с помощью проточной цитометрии. (D) Тепловая карта показывает z-баллы для определенного FPKM генов, экспрессируемых на стадиях ESC, EB и NPC. Были идентифицированы четыре различных кластера генов, обозначающих группы генов, которые дифференциально экспрессируются на стадии ESC, EB или NPC. (E)Анализ GO проводился с использованием пакета R, clusterProfiler, на четырех кластерах, идентифицированных в RNA-seq. (F) На графике показаны значения FPKM для трех других маркеров плюрипотентности, Sox2, Klf4и Myc, а также нейронные маркеры NeuN, Map2и Tubb3 для клеток E14 на стадиях ESC, EB день 3 и NPC день 8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод нейронной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мышей был установлен в течение десятилетий, и исследователи продолжали модифицировать предыдущие протоколы или создавать новые для различных целей7,10,11. Мы использовали серию анализов для всестороннего анализа эффективности и прогресса стадий дифференцировки mESCs к нейронам, которые могут быть использованы при анализе другой дифференциации линий ЭСК мыши или человека. Кроме того, наши подходы оказались полезными инструментами для оценки влияния конкретных генов или путей на дифференцировку нейронов in vitro8.
С помощью наших методов плюрипотентные незафиксированные ЭСК, обработанные ретиноевой кислотой (РА), связываются с нейронной линией с высокой эффективностью и далее индуцируются для генерации нейронов7. Для улучшения успешной дифференцировки ЭС-клеток в нервные клетки и уменьшения неоднородности важно поддерживать ЭС-клетки в недифференцированном состоянии12. Непролиферативные MEF, обработанные γ облучением или митомицином С, функционируют для поддержания плюрипотентности ЭСК и обеспечивают каркас для их роста13,14. Чтобы получить последовательные результаты, мы начинаем каждый эксперимент по дифференциации с mESCs, культивируемых на γ облученных MEF. После нескольких проходов облученные γ MEF вымирают, и культура в конечном итоге становится однородной для клеток mESC. Альтернативно, mESCs могут быть предварительно покрыты желатином в течение примерно 45 мин, прежде чем γ облученные MEF будут посеяны, чтобы лучше удалить их на следующем проходе. Фактор ингибирования лейкемии (LIF) уже давно используется для поддержания плюрипотентного состояния культивируемых ES-клеток мыши путем активации пути JAK / STAT15,16,17. Совсем недавно было обнаружено, что PD0325901 (PD, ингибитор MEK) и CHIR99021 (CH, ингибитор GSK) обеспечивают дополнительное поддержание плюрипотентности клеток ES3,18. В нашем протоколе мы культивируем mESCs с этими ингибиторами вместе с LIF для поддержания высокой плюрипотентности mESCs.
Другим решающим фактором для достижения успешной дифференциации является качество ЭБ. Мы выполняем дифференцировку клеток Е14 методом висячей капли, который применялся другими исследователями5,19,20. При этом методе одиночным ЭС-клеткам дают приостановиться в капельке дифференцирующей среды в течение 2 дней, где они спонтанно агрегируются и образуют ЭБ. Полученные ЭБ, как правило, более четко определены с точки зрения их морфологии(рисунок 2B)по сравнению с методом суспендирования изолированных мЭСК в среде, что приводит к размерам EB в гораздо более широком диапазоне в нашем опыте (данные не показаны). Чтобы предотвратить прикрепление ЭБ к пластинам, важно выполнять вращение с низкой скоростью, начиная с 3-го дня, продолжая процесс дифференциации. ЭБ дифференцируются в NPC путем лечения их РА. Полученные NPC от лечения РА на EB день 4 обычно гетерогенны для нервных клеток, таких как олигодендроциты и астроциты21. Используя RT-qPCR или иммунофлуоресценцию, популяция NPC может быть исследована на наличие нейронов и других маркеров нейронной линии, таких как Gfap для астроцитов и Olig2 для олигодендроцитов. Чтобы дополнительно индуцировать дифференцировку NPC в нейроны, NPC культивируются в оптимальной нейронной среде, где наиболее важными компонентами являются добавки N2 и B27. Добавка N2 в основном функционирует, чтобы помочь NPC связаться с нейронной линией, в то время как добавка B27 функционирует для поддержания долговечности нейронов.
Образцы могут быть собраны в течение периода дифференцировки (например, стадия ESC, EB день 2, EB день 4, NPC день 6, NPC день 8, нейроны день 10 и нейроны день 12) для отслеживания процесса дифференцировки путем выполнения RT-qPCR для маркеров плюрипотентности и эктодермы. Сравнение маркеров плюрипотентности, таких как Oct4, Nanog, Sox2, Klf4и Myc между различными клеточными стадиями, позволит проверить плюрипотентность mESCs(рисунок 3B, F). Для исследования эффективности нейронной дифференциации используются маркеры для слоя мезодермы, такие как Hand1, Snai1и Tbxt; и слой энтодермы, такой как Eomes и Gata4, также может быть исследован (данные не показаны). Дальнейшая проверка может быть выполнена с иммунофлуоресцентным (IF) зондированием NPC или нейрональных маркеров(рисунок 3A). Однако эти методы не являются количественными и смещены в сторону выбранных маркеров. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы включаем проточную цитометрию и анализ РНК-сек(рисунок 3C\u2012F). Клеточная линия, используемая в эксперименте по проточной цитометрии, представляет собой клеточную линию Sox1-GFP E14, которая была использована специально в этом эксперименте для оценки качества процедуры дифференцировки NPC. Sox1 является одним из самых ранних специфических нейрональных маркеров во время развития нейроэктодермы22, что делает его отличным маркером для линии NPC. Sox1 можно исследовать для использования RT-qPCR или вестерн-блоттинга для оценки популяции NPC. Эти анализы особенно полезны для исследования дефекта дифференцировки, вызванного генными манипуляциями или химической обработкой.
Важно отметить, что есть несколько ограничений для нашего протокола, представленного здесь. Прежде всего, мы представляем только комплексный анализ для одной клеточной линии mESC дикого типа. Другие линии ESC, происходящие от мышей или людей, могут потребовать изменений и дальнейшей оптимизации в протоколе для обеспечения успешной и эффективной дифференцировки нейронов. Во-вторых, мы представляем метод дифференцировки нейронов in vitro, который, естественно, имеет свой собственный набор ограничений. Как упоминалось ранее, ЭБ лечатся супрафизиологическим уровнем РА, чтобы подтолкнуть их к линии NPC. Полученные NPC затем помещаются в нейронно-оптимальные среды, чтобы имитировать физиологические условия и стимулировать приверженность нейронной линии, рост и долголетие. Здесь добавки N2 и B27 используются для культивирования нейронов, но также доступны другие добавки, такие как NS2123 для аналогичных целей, что может изменить успех и эффективность дифференцировки нейронов. Эти условия синтетически воссоздаются в анализах клеточной культуры, которые могут не полностью представлять физиологические условия. Качество ЭБ, NPC и нейронов сильно зависит от начальных мЭСК. mESCs, которые были пройдены слишком много раз и сохранены в культуре более 1 недели, обычно начинают терять плюрипотентность и могут не успешно проходить дифференциацию. Таким образом, поддержание mESCs в оптимальном состоянии является ключом к обеспечению того, чтобы они могли эффективно дифференцироваться в EB, NPC и нейроны. Другие методы культивирования нейронов, такие как 3D-модели, также были предложены для лучшей имитации физиологических условий24,25,26 иногда за счет пропускной способности и осуществимости27,28. Мы считаем, что наши протоколы полезны для характеристики этих 3D-моделей культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что конкурирующих финансовых интересов нет.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом NIH (1R35GM133496-01) З. Гао. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Райана Хоббса за помощь в секционировании. Мы благодарим основные объекты Медицинского колледжа штата Пенсильвания, включая науки о геноме и биоинформатику, передовую визуализацию световой микроскопии и проточную цитометрию. Мы также благодарим доктора Юку Имамуру за помощь в анализе РНК-seq.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| - Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| - Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| - Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| - Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
References
- Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
- Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
- Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
- Park, Y. -G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
- Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
- Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
- Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
- Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
- Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
- Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
- Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).
