Mesure dynamique et imagerie des capillaires, artérioles et péricytes dans le cœur de souris
Summary
Présenté ici est un protocole pour étudier la microcirculation coronaire dans le tissu cardiaque murin vivant par la surveillance ex vivo de la pression artérielle de perfusion et le flux qui maintient la pression, ainsi que les composants vasculaires de l’arbre, y compris les lits capillaires et péricytes, que l’artère septale est cannulée et pressurisée.
Abstract
Le tonus coronaire avec l’ouverture ou la fermeture des capillaires déterminent en grande partie le flux sanguin vers les cardiomyocytes à la pression constante de perfusion. Cependant, il est difficile de surveiller les changements dynamiques des artérioles coronaires et des capillaires dans tout le cœur, principalement en raison de son mouvement et de ses battements non-stop. Ici, nous décrivons une méthode qui permet de surveiller le taux de perfusion artérielle, la pression et les changements de diamètre des artérioles et capillaires dans les muscles papillaires ventriculaires droit de la souris. L’artère septale de la souris est cannulée et perfusée à un débit ou une pression constant avec l’autre mesurée dynamiquement. Après perfusion avec une lectine étiquetée fluorescente (p. ex., Alexa Fluor-488 ou -633 étiquetée Wheat-Germ Agglutinin, WGA), les artérioles et capillaires (et autres vaisseaux) du muscle papillaire et du septum du ventricule droit pouvaient être facilement imités. Les changements de diamètre du vaisseau pourraient alors être mesurés en présence ou en absence de contractions cardiaques. Lorsque des protéines fluorescentes génétiquement codées ont été exprimées, des caractéristiques spécifiques ont pu être surveillées. Par exemple, les péricytes ont été visualisés dans des cœurs de souris qui exprimaient NG2-DsRed. Cette méthode a fourni une plate-forme utile pour étudier les fonctions physiologiques des péricytes capillaires dans le cœur. Il convient également à l’étude de l’effet des réhésifs sur le flux sanguin dans le cœur en mesurant simultanément le diamètre vasculaire/capillaire et la pression luminaire artérielle. Cette préparation, combinée à un système d’imagerie optique à la fine pointe de la technologie, permet d’étudier le flux sanguin et son contrôle au niveau cellulaire et moléculaire dans le cœur dans des conditions quasi physiologiques.
Introduction
Une régulation appropriée du débit de pression coronaire assure un approvisionnement suffisant en sang au cœur pour répondre à ses exigences métaboliques1. Cependant, il n’est devenu clair que récemment comment le flux de pression coronaire est dynamiquement régulé dans le cœur, malgré des études approfondies qui ont été effectuées in vivo et in vitro au cours des dernières décennies. L’une des raisons est la difficulté d’établir un modèle de travail physiologique pour de telles études en raison du battement constant du cœur. Quoi qu’il en soit, une variété de méthodes ont été établies pour l’observation des micro-vaisseaux coronaires dans les tissus vivants ou les animaux, mais aucune de ces méthodes n’a été en mesure d’atteindre une concentration constante / stable et les mesures de la pression, le débit et le diamètre microvasculaire enmême temps 2,3. La visualisation directe des micro-vaisseaux artériaux coronaires dans le cœur battant a été introduite ily a des décennies 4,3, mais les mesures de diamètre dans les petits vaisseaux étaient difficiles et les fonctions spécifiques des nombreux types de cellules spécialisées associées à la microcirculation étaient tout aussi vexante. Même la méthode stroboscopique et le système d’objectif flottant ne pouvaient pas fournir les informations ci-dessus simultanément5. Néanmoins, une quantité importante d’informations précieuses a été obtenue en utilisant les technologies susmentionnées, qui nous ont aidés à mieux comprendre la régulation du flux sanguin coronaire6. La méthode que nous décrivons dans cet article aidera à étudier et à comprendre en détail comment les composants des artères coronaires, les artérioles et la microvasculature réagissent différemment aux stimulations et aux demandes métaboliques.
Le modèle de travail que nous avons établi pour poursuivre ces études a été construit sur les travaux antérieurs de Westerhof et coll.2. Après cannulation de l’artère septale du coeur de souris, la solution saline physiologique a été employée pour parcourir cette artère pour maintenir les myocytes et d’autres composants du tissu cardiaque nourris. La pression artérielle de perfusion, le flux et le diamètre vasculaire ont été surveillés parmi d’autres fonctions physiologiques utilisant des indicateurs fluorescents appropriés. Cette méthode nous permet de visualiser le lit microvasculaire coronaire sous pression physiologique dans les tissus vivants et d’étudier pour la première fois les mécanismes cellulaires sous-jacents à la régulation de la microcirculation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans le présent travail, nous avons introduit une méthode ex vivo remarquablement simple mais très pratique pour étudier la microcirculation coronaire dans le cœur dans des conditions physiologiques. Cette méthode a été modifiée à partir d’investigations mécaniques à l’aide de rats2. L’ajout stimulant a été la technologie d’imagerie à grande vitesse et haute résolution optique. Nous avons donc pu tirer parti des systèmes d’imagerie optique avancés qui sont maintenant di…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus en partie par le Center for Biomedical Engineering and Technology (BioMET); NIH (1U01HL116321) et (1R01HL142290) et l’American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).
Materials
| 1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
References
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