Динамическое измерение и визуализация капилляров, артериол и перицитов в сердце мыши
Summary
Здесь представлен протокол для изучения коронарной микроциркуляции в живой ткани сердца мурина путем ex vivo мониторинга артериального давления перфузии и потока, который поддерживает давление, а также сосудистых компонентов дерева, включая капиллярные кровати и перициты, как перегородка артерии канюлизируется и под давлением.
Abstract
Коронарный артериальный тон наряду с открытием или закрытием капилляров в значительной степени определяют приток крови к кардиомиоцитам при постоянном перфузионом давлении. Однако трудно контролировать динамические изменения коронарных артериол и капилляров во всем сердце, в первую очередь из-за его движения и нон-стоп избиения. Здесь мы описываем метод, который позволяет контролировать скорость артериальной перфузии, давление и диаметр изменений артериол и капилляров в мыши правой желудочковой папиллярных мышц. Мышь перегородки артерии cannulated и проникнуты при постоянном потоке или давления с другими динамически измеряется. После перфузии с флуоресцентно помечены лектин (например, Alexa Fluor-488 или -633 помечены Пшеница-Герм Агглютинин, WGA), артериолы и капилляры (и другие сосуды) в правом желудочка папиллярной мышцы и перегородки могут быть легко изображены. Изменения диаметра сосуда могут быть измерены при наличии или отсутствии сокращений сердца. Когда генетически закодированные флуоресцентные белки были выражены, конкретные особенности могут быть проверены. Для примеров перициты визуализировались в сердцах мышей, которые выражали NG2-DsRed. Этот метод предоставил полезную платформу для изучения физиологических функций капиллярных перицитов в сердце. Он также подходит для изучения влияния реагентов на кровоток в сердце путем измерения диаметра сосудов/капилляров и артериального светимого давления одновременно. Этот препарат, в сочетании с современной системой оптической визуализации, позволяет изучать кровоток и его контроль на клеточном и молекулярном уровне в сердце в почти физиологических условиях.
Introduction
Соответствующая регулировка коронарного давления обеспечивает достаточное кровоснабжение сердца для удовлетворения его метаболических потребностей1. Тем не менее, только недавно стало ясно, как коронарное давление регулируется в сердце, несмотря на обширные исследования, которые были проведены in vivo и in vitro в течение последних десятилетий. Одной из причин является трудность в создании физиологической рабочей модели для таких исследований из-за постоянного бия сердца. Несмотря на это, были созданы различные методы для наблюдения коронарных микросудов в живых тканях или животных, но ни один из этих методов не смогли достичь постоянного / стабильного фокуса и измерения давления, потока и микрососудистого диаметра в то жевремя 2,3. Прямая визуализация коронарных артериальных микро-сосудов в бьющеесясердце была введена десятилетия назад 4,3, но диаметр измерений в малых сосудах была сложной и специфические функции многих специализированных типов клеток, связанных с микроциркуляции в равной степени досадно. Даже стробоскопический метод и плавающая объективная система не могли предоставить вышеупомяую информациюодновременно 5. Тем не менее, значительный объем ценной информации был получен с использованием вышеупомянутых технологий, которые помогли нам понять больше о регулировании коронарного кровотока6. Метод, который мы описываем в этой статье, поможет исследовать и детально понять, как компоненты коронарных артерий, артериол и микроваскулярно по-разному реагируют на стимуляцию и метаболические потребности.
Рабочая модель, которую мы создали для проведения этих исследований, была построена на предыдущей работе Westerhof et al.2. После канюляции перегородки сердца мыши, физиологический солевой раствор был использован для окутыния этой артерии, чтобы сохранить миоциты и другие компоненты сердечной ткани питается. Артериальное давление перфузии, течение и диаметр сосудов отслеживались среди других физиологических функций с использованием соответствующих флуоресцентных индикаторов. Этот метод позволяет нам впервые визуализировать коронарную микрососудикулярную кровать под физиологическим давлением в живой ткани и изучить клеточные механизмы, лежащие в основе регуляции микроциркуляции.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящей работе мы внедрили удивительно простой, но очень практичный метод ex vivo для изучения коронарной микроциркуляции сердца в физиологических условиях. Этот метод был изменен из механических исследований с использованиемкрыс 2. Сложным дополнением была технология ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана Центром биомедицинской инженерии и технологий (BioMET); NIH (1U01HL116321) и (1R01HL142290) и Американская ассоциация сердца 10SDG4030042 (G), 19POST34450156 (HCJ).
Materials
| 1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
References
- Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
- Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart. Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).
- Tillmanns, H., et al. Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle. Circulation Research. 34, 561-569 (1974).
- Martini, J., Honig, C. R. Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply. Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).
- Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques. Circulation Research. 49, 342-353 (1981).
- Marcus, M. L., et al. Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level. Circulation. 82, 1-7 (1990).
- Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation. Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).
- Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries. Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).
- Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).
- Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion. Circulation. 89, 2412-2420 (1994).
- Lawton, P. F., et al. a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology. Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).
