Fare Kalbinde Kılcal Damarlar, Arterioles ve Perisitlerin Dinamik Ölçümü ve Görüntülenmesi
Summary
Burada, septal arter kanüle edildiği ve basınçlandırıldığı için kılcal yataklar ve perisitler de dahil olmak üzere damar ağacı bileşenlerinin yanı sıra basıncı koruyan arteriyel perfüzyon basıncının ve akışının eks vivo izlenmesi ile canlı murine kalp dokusundaki koroner mikrositülasyonu incelemek için bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Kılcal damarların açılması veya kapanması ile birlikte koroner arteriyel ton, sabit perfüzyon basıncında kardiyomiyositlere kan akışını büyük ölçüde belirler. Bununla birlikte, koroner arteriyüllerin ve tüm kalpteki kılcal damarların dinamik değişikliklerini, öncelikle hareketi ve durmadan atması nedeniyle izlemek zordur. Burada, fare sağ ventrikül papiller kaslarındaki arteriyel perfüzyon oranının, basıncının ve arteriyüllerin ve kılcal damarların çap değişikliklerinin izlenmesini sağlayan bir yöntemi açıklıyoruz. Fare septal arteri, dinamik olarak ölçülen diğer ile sabit bir akışta veya basınçta kanüle edilir ve perfüzyona edilir. Floresan etiketli bir lektin (örneğin, Alexa Fluor-488 veya -633 wheat-germ Agglutinin, WGA) etiketli perfüzyondan sonra, sağ ventrikül papiller kas ve septumdaki arteriüller ve kılcal damarlar (ve diğer damarlar) kolayca görüntülenebilir. Damar çapı değişiklikleri daha sonra kalp kasılmalarının varlığında veya yokluğunda ölçülebilir. Genetik olarak kodlanmış floresan proteinler ifade edildiğinde, belirli özellikler izlenebilirdi. Örneğin, perisitler NG2-DsRed’i ifade eden fare kalplerinde görselleştirildi. Bu yöntem, kalpteki kılcal perisitlerin fizyolojik işlevlerini incelemek için yararlı bir platform sağlamıştır. Damar/kılcal çapı ve arteriyel ışık basıncını aynı anda ölçerek reaktiflerin kalpteki kan akışı üzerindeki etkisini incelemek için de uygundur. Bu preparat, son teknoloji optik görüntüleme sistemi ile birlikte, kişinin kan akışını ve kontrolünü fizyolojik koşullar altında kalpteki hücresel ve moleküler düzeyde incelemesini sağlar.
Introduction
Uygun koroner basınç akışı düzenlemesi, kalbin metabolik taleplerini karşılamak için yeterli kan akışını sağlar1. Bununla birlikte, son on yıldır in vivo ve in vitro olarak yapılan kapsamlı çalışmalara rağmen, koroner basınç akışının kalpte nasıl dinamik olarak düzenlendiği daha yeni ortaya çıktı. Bunun nedenlerinden biri, kalbin sürekli atması nedeniyle bu tür çalışmalar için fizyolojik bir çalışma modeli oluşturmanın zorluğudur. Ne olursa olsun, koroner mikro damarların canlı dokularda veya hayvanlarda gözlemlenmesi için çeşitli yöntemler oluşturulmuştur, ancak bu yöntemlerin hiçbiri sabit / kararlı odak ve basınç, akış ve mikrovasküler çap ölçümlerini aynı anda elde edemedi2,3. Atan kalpte koroner arteriyel mikro damarların doğrudan görselleştirilmesi on yıllar önce tanıtıldı4,3, ancak küçük damarlardaki çap ölçümleri zorluydu ve mikrosirkülasyonla ilişkili birçok özel hücre tipinin spesifik işlevleri eşit derecede can sıkıcıydı. Stroboscopic yöntem ve yüzen nesnel sistem bile yukarıdaki bilgileri aynı anda sağlayamadı5. Bununla birlikte, koroner kan akışının düzenlenmesi hakkında daha fazla bilgi edinmemize yardımcı olan yukarıda belirtilen teknolojiler kullanılarak önemli miktarda değerli bilgi elde edilmiştir6. Bu makalede anlattığımız yöntem, koroner arterlerin, arterioles ve mikrovasküler arter bileşenlerinin stimülasyonlara ve metabolik taleplere nasıl farklı yanıt verdiğini ayrıntılı olarak araştırmamıza ve anlamamıza yardımcı olacaktır.
Bu çalışmaları sürdürmek için kurduğumuz çalışma modeli Westerhof ve ark.2’ninönceki çalışmaları üzerine inşa edildi. Fare kalbinin septal arterinin kanülasyonunu takiben, kalp dokusunun miyositlerini ve diğer bileşenlerini besleyen arteri boğmak için fizyolojik salin çözeltisi kullanıldı. Arteriyel perfüzyon basıncı, akış ve damar çapı diğer fizyolojik fonksiyonlar arasında uygun floresan göstergeler kullanılarak izlendi. Bu yöntem, canlı dokuda fizyolojik basınç altında koroner mikrovasküler yatağı görselleştirmemizi ve mikro sirkülasyon regülasyonunun altında yatan hücresel mekanizmaları ilk kez incelememizi sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut çalışmada, fizyolojik koşullar altında kalpteki koroner mikroskrkülasyonu incelemek için son derece basit ama son derece pratik bir ex vivo yöntemi sunduk. Bu yöntem, sıçanlar kullanılarak mekanik araştırmalardan değiştirilmiştir2. Zorlu ek, yüksek hızlı ve yüksek optik çözünürlüğe sahip görüntüleme teknolojisiydi. Bu nedenle, şu anda piyasada bulunan gelişmiş optik görüntüleme sistemlerinden yararlanabildik. Çalışan papiller kas preparatının uygun b…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Biyomedikal Mühendisliği ve Teknolojisi Merkezi (BioMET) tarafından desteklendi; NIH (1U01HL116321) ve (1R01HL142290) ve Amerikan Kalp Derneği 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).
Materials
| 1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
References
- Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
- Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart. Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).
- Tillmanns, H., et al. Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle. Circulation Research. 34, 561-569 (1974).
- Martini, J., Honig, C. R. Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply. Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).
- Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques. Circulation Research. 49, 342-353 (1981).
- Marcus, M. L., et al. Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level. Circulation. 82, 1-7 (1990).
- Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation. Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).
- Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries. Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).
- Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).
- Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion. Circulation. 89, 2412-2420 (1994).
- Lawton, P. F., et al. a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology. Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).
