Summary
Hier beschrijven we een eenvoudige, goedkope en snelle clearing methode om de 3D-structuur van zowel muis- als menselijk wit vetweefsel op te lossen met behulp van een combinatie van markers om vasculatuur, kernen, immuuncellen, neuronen en lipidedruppelcoateiwitten te visualiseren door fluorescerende beeldvorming.
Abstract
Obesitas is een belangrijk wereldwijd probleem op het gebied van de volksgezondheid dat het risico op het ontwikkelen van hart- en vaatziekten, diabetes type-2 en leverziekten verhoogt. Obesitas wordt gekenmerkt door een toename van vetweefsel (AT) massa als gevolg van adipocyte hyperplasie en / of hypertrophia, wat leidt tot een grondige verbouwing van de driedimensionale structuur. Inderdaad, de maximale capaciteit van AT om uit te breiden tijdens obesitas is cruciaal voor de ontwikkeling van obesitas-geassocieerde pathologieën. Deze AT-expansie is een belangrijk homeostatisch mechanisme om aanpassing aan een overmaat aan energie-inname mogelijk te maken en om schadelijke lipide-overloop naar andere metabole organen, zoals spieren en lever, te voorkomen. Daarom is het begrijpen van de structurele verbouwing die leidt tot het falen van AT-expansie een fundamentele vraag met een hoge klinische toepasbaarheid. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige en snelle clearingmethode die routinematig wordt gebruikt in ons laboratorium om de morfologie van muis en menselijk wit vetweefsel te verkennen door fluorescerende beeldvorming. Deze geoptimaliseerde AT clearing methode is gemakkelijk uit te voeren in elk standaard laboratorium uitgerust met een chemische kap, een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker en een fluorescerende microscoop. Bovendien zijn de gebruikte chemische verbindingen direct beschikbaar. Belangrijk is dat deze methode het mogelijk maakt om de 3D AT-structuur op te lossen door verschillende markers te bevlekken om specifiek de adipocyten, de neuronale en vasculaire netwerken en de aangeboren en adaptieve immuuncellenverdeling te visualiseren.
Introduction
Obesitas wordt gekenmerkt door een toename van vetweefsel massa en is uitgegroeid tot een belangrijke wereldwijde volksgezondheid probleem, gezien het feit dat mensen met obesitas hebben een verhoogd risico op het ontwikkelen van hart-en vaatziekten, type-2 diabetes, leverziekten en sommige vormen van kanker.
Een fundamentele fysiologische functie van vetweefsel is het moduleren van lichaam-lichaam glucose en lipide homeostase1,2. Tijdens de voederperiode slaan de adipocyten (d.w.z. de belangrijkste cellen van het vetweefsel) het teveel aan glucose en lipiden op die door een maaltijd in triglyceriden worden verstrekt. Tijdens het vasten breken de adipocyten de triglyceriden af in niet-gestreelde vetzuren en glycerol om de energievraag van het lichaam te ondersteunen. Tijdens de ontwikkeling van obesitas breidt vetweefsel uit door de grootte (hypertrophia) en/of het aantal (hyperplasie) van adipocyten1te vergroten, om hun opslagcapaciteit te vergroten. Wanneer de expansie van vetweefsel zijn limiet bereikt, een constante zeer variabele bij patiënten, de resterende lipiden accumuleert in andere metabole organen, waaronder spieren en lever3,4, wat leidt tot hun functionele falen en het initiëren van obesitas-gerelateerde cardio-metabole complicaties1,5. Daarom is het identificeren van de mechanismen die de expansie van vetweefsel regelen een belangrijke klinische uitdaging.
De morfologische modificaties gedocumenteerd in vetweefsels tijdens obesitas zijn gekoppeld aan zijn pathologische disfunctie. Verschillende kleuringsprocedures zijn gebruikt om de weefselorganisatie van het vetweefsel te beschrijven, waaronder actine6, vasculaire markers7, lipidedruppelmarkers8en specifieke immuuncelmarkers9,10. Vanwege de enorme diameter van adipocyten (50 tot 200 μm)11is het echter essentieel om een groot deel van het hele weefsel in drie dimensies te analyseren om de dramatische structurele AT-veranderingen die tijdens obesitas worden waargenomen, nauwkeurig te analyseren. Omdat het licht echter geen ondoorzichtig weefsel binnendringt, is beeldvorming in 3D binnen een groot weefselmonster met behulp van fluorescentiemicroscopie niet mogelijk. Methoden van weefselclearing om ze transparant te maken zijn gemeld in de literatuur (voor een onderzoek, zie12) waardoor men weefsels kan wissen en diepgaande, hele weefselfluorescentiemicroscopie kan uitvoeren. Deze methoden bieden ongekende mogelijkheden om de 3D cellulaire organisatie in gezond en ziek weefsel te beoordelen. Elk van de beschreven methoden hebben voor- en nadelen en moet daarom zorgvuldig worden geselecteerd, afhankelijk van het bestudeerde weefsel (zie13). Sommige benaderingen vereisen immers een lange incubatietijd en/of het gebruik van materialen of verbindingen die duur, giftig of moeilijk te verkrijgen zijn14,15,16,17,18,19. Profiterend van een van de eerste verbindingen die werner Spalteholz een eeuw geleden gebruikte om weefsels20te wissen, hebben we een gebruiksvriendelijk en goedkoop protocol opgezet dat zeer goed is aangepast voor het opruimen van alle muis- en menselijke vetweefseldepots in elk laboratorium met typische apparatuur, waaronder een chemische kap, een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker en een confocale microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol werd getest en is gevalideerd voor alle muis- en menselijke witte vetweefseldepots. Menselijke en muisvetweefsels werden dienovereenkomstig verzameld aan Europese wetten en goedgekeurd door Franse en Zweedse Ethische commissies.
1. Fixatie van muis en menselijk wit vetweefsel
- Dompel de geoogste muis of menselijke witte vetweefsels onder in ten minste 10 mL PBS met 4% paraformaldehyde (PFA) in een plastic buis van 15 mL.
- Schud de plastic buis bij kamertemperatuur op een rolplaat gedurende 1 uur.
- Laat de plastic buis 's nachts op een rolplaat op een rolplaat staan om de fixatie te voltooien.
OPMERKING: Dit protocol is aangepast voor grote vetweefselmonsters, zoals hele epididymale vetpads verkregen van muizen die een normaal dieet (≈250 mg - ≈0,6 cm3) kregen. Voor grotere monsters zoals epididymale vetpads verkregen van muizen gevoed een vetrijk dieet (≈1,5 g - ≈4 cm3) of menselijke vetweefsel monsters, hoewel het clearingprotocol perfect zou moeten werken voor het hele monster (door de PFA en de antilichaammengsels op te schalen), snijden we in het algemeen weefselstukken rond 1 g (≈2,5 cm3)om de resterende monsters te reserveren voor extra kleuring of toepassingen. Voor de PFA (stap 1.1.) raden we aan om ongeveer 10 keer het volume van het weefsel te gebruiken. Voor de antilichaammengsels (stappen 3.1. en 3.4.) verhoog het volume om het weefsel volledig onder te dompelen en gebruik een plastic buis van 15 mL (zie tabel met materialen)als het weefsel te groot is voor een plastic microtube van 1,5 mL (zie tabel met materialen).
2. Permeabilisatie en verzadiging van muis- en menselijk wit vetweefsel
- Spoel het vaste witte vetweefsel in 10 mL PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om alle sporen van PFA te verwijderen.
- Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,3% glycine (zie tabel van materialen)en schud de buis bij kamertemperatuur in een orbitale shaker voor 1 uur bij 100 omwentelingen per minuut (rpm) om de resterende vrije aldehyde groepen te blussen.
- Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100 (zie Tabel van Materialen)en schud de buis bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker gedurende 2 uur bij 100 rpm.
- Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100 en 20% DMSO (zie Tabel van Materialen)en schud de buis bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker bij 100 rpm 's nachts.
- Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,1% Tween-20 (zie tabel met materialen),0,1% Triton X-100, 0,1% deoxycholaat (zie tabel met materialen)en 20% DMSO en schud de buis bij 37 °C in een temperatuurgestuurde orbitale shaker bij 100 tpm gedurende ten minste 24 uur.
- Spoel het weefsel in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100 en schud de buis bij kamertemperatuur in een orbitale shaker bij 100 rpm gedurende 1 uur.
- Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100, 10% DMSO en 3% BSA (zie Tabel van materialen)en schud de buis bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker bij 100 rpm voor 12 uur, om alle sites te verzadigen die specifiek antilichamen konden binden.
OPMERKING: In stap 2.7 kan de BSA worden vervangen door bloedserum van de soorten van het gebruikte secundaire antilichaam.
3. Kleuringsprocedure voor muis- en menselijk wit vetweefsel
- Breng het weefsel over in een plastic microbuis van 1,5 mL met 300 μL PBS, aangevuld met 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA en de primaire antilichamen (10x meer geconcentreerd dan voor cryosection-vlekken, maar optimale concentratie van antilichamen moet voor elk antilichaam worden geëvalueerd). Bescherm de buis tegen licht door de bekleding met aluminiumfolie en schud de buis bij 37 °C in een temperatuurgestuurde orbitale shaker bij 100 tpm gedurende ten minste twee dagen (zie de noot in stap 1.1 en stap 3.7.1).
- Spoel het weefsel in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100, 10% DMSO en 3% BSA en schud de buis beschermd tegen licht bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker bij 100 rpm gedurende 5 uur. Voer deze stap twee keer uit.
- Spoel het weefsel in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100, 10% DMSO en 3% BSA en schud de buis, beschermd tegen licht, bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker bij 100 tpm gedurende een nacht tot twee dagen.
- Breng het weefsel over op een 1,5 mL plastic microbuis met 300 μL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA en de secundaire antilichamen (10x meer geconcentreerd dan voor cryosection vlekken). Bescherm de buis tegen licht door de bekleding met aluminiumfolie en schud de buis bij 37 °C in een temperatuurgestuurde orbitale shaker bij 100 tpm gedurende ten minste twee dagen (zie de noot in stap 1.1 en stap 3.7.1).
- Spoel het weefsel in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100, 10% DMSO en 3% BSA en schud de buis, beschermd tegen licht, bij 37 °C in een temperatuurgestuurde orbitale shaker bij 100 tpm gedurende 5 uur. Voer deze stap twee keer uit.
- Spoel het weefsel in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100, 10% DMSO en 3% BSA en schud de buis, beschermd tegen licht, bij 37 °C in een temperatuurgestuurde orbitale shaker bij 100 tpm gedurende een nacht tot twee dagen.
- Spoel het weefsel in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS en schud de buis, beschermd tegen licht, bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker bij 100 tpm gedurende 2 uur.
OPMERKING: Voor de etikettering van specifieke structuren zoals kernen of actine moet bij stap 3.1 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI of gelijkwaardig) en/of fluorescerend geëtiketteerd worden toegevoegd. wanneer alleen fluorescerend geëtiketteerde primaire antilichamen worden gebruikt, of bij stap 3.4. wanneer secundaire antilichamen worden gebruikt.
OPMERKING: Voor de kleuringsprocedure kunnen primaire antilichamen die al zijn geconjugeerd met fluorchromen (zoals die worden gebruikt voor stroomcytometrie) worden gebruikt en we raden het aan voor de winst van tijd en specificiteit. Zelfs als de primaire antilichamen van muizen kunnen worden gebruikt gevolgd door secundaire antimuisantilichamen, zoals we het hier hebben aangetoond, hebben we vaak niet-specifieke kleuring van bloedvaten waargenomen als gevolg van circulerende immunoglobuline. Daarom, om dit probleem te voorkomen, primaire antilichamen die al zijn geëtiketteerd zijn sterk aanbevolen en hier leveren we bewijs dat de antilichamen die worden gebruikt in flow cytometrie compatibel zijn met onze procedure. In het specifieke geval van een antigeen dat op lage niveaus wordt uitgedrukt, is echter een signaalversterkingsstap via secundaire antilichamen verplicht; wanneer het enige beschikbare primaire antilichaam bij de muis wordt gemaakt, kan een hartperfusie van de muizen met PBS gedurende ten minste 5 minuten bij het offer een groot deel van de circulerende immunoglobuline en dus de niet-specifieke kleuring verwijderen.
4. Clearing procedure voor muis en menselijk wit vetweefsel
- Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL ethanol van 50% en schud de buis, beschermd tegen licht, bij kamertemperatuur in een orbitale shaker bij 100 rpm gedurende 2 uur.
- Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL ethanol van 70% en schud de buis, beschermd tegen licht, bij kamertemperatuur in een orbitale shaker bij 100 rpm gedurende 2 uur.
- Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL ethanol van 95% en schud de buis, beschermd tegen licht, bij kamertemperatuur in een orbitale shaker bij 100 rpm gedurende 2 uur.
- Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL ethanol van 100% en schud de buis, beschermd tegen licht, bij kamertemperatuur in een orbitale shaker bij 100 rpm gedurende 2 uur.
- Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL ethanol van 100% ethanol en schud de buis, beschermd tegen licht, bij kamertemperatuur in een orbitale shaker bij 100 rpm 's nachts.
- Dompel het weefsel onder in een glazen fles van 20 mL met een plastic dop (zie tabel met materialen) met 5 mL methyylsalicylaat (zie tabel van materialen)onder een chemische kap en schud de glazen container, beschermd tegen licht, bij kamertemperatuur in een orbitale shaker bij 100 rpm gedurende ten minste 2 uur.
OPMERKING: De clearingprocedure kan aanzienlijk worden versneld (indien nodig) door stap 4.3 te vermijden. en 4.5., hoewel de uiteindelijke clearing kwaliteit zou iets worden verminderd.
5.3D-confocale beeldvorming van gewist wit vetweefsel
- Breng het weefsel over naar een metalen beeldkamer voorzien van een glazen bodem (zie tabel met materialen)onder een chemische kap en vul de kamer met verse methyylsalicylaat.
OPMERKING: Om het weefsel op zijn plaats te krijgen en zo te voorkomen dat het in de kamer zweeft of zijwaarts beweegt, breng je meerdere ronde glazen covers van 18 mm (zie tabel van materialen)aan bovenop het weefsel bij het monteren in de kamer. - Plaats de beeldkamer op een omgekeerde confocale microscoop.
- Beeld het weefsel met behulp van een lage vergroting doelstelling (bijvoorbeeld, 4x doelstelling) om een paar cm3 3D-kaarten van het hele vetweefsel of van het menselijk weefsel monster te genereren.
- Selecteer verschillende gebieden voor de weefselbemonstering bij een hogere vergroting. Gebruik doorgaans een 20x lange afstandsluchtdoelstelling die een goede verhouding biedt tussen resolutie en diepte. We verwerven grote mozaïekbeelden met z-stacks tussen 600 en 2000 μm diepte.
OPMERKING: Gebruik een langeafstandsdoelstelling om dieper in het weefsel te beelden.
6. Extractie van kwantitatieve resultaten van de 3D-vetweefselbeelden
OPMERKING: De segmentatie van de verschillende structuren en de daaropvolgende extractie van de kwantitatieve informatie uit de 3D-image stack gegenereerd in punt 5 kan worden uitgevoerd met behulp van een van de vele bestaande image analysis software opties, hetzij commerciële of freeware. In de volgende punten beschrijven we een strategie die routinematig wordt gebruikt in ons laboratorium om kwantitatieve informatie te extraheren uit 3D-vetweefselafbeeldingen met behulp van commerciële software (zie Tabel van Materialen).
- Converteer de 3D-stacks op het softwareformaat naar vrijgemaakte geheugenruimte.
- Segmenteer de cellen.
- Open de celmodule van de software.
- Wijzig de instelling Celdetectie in plasmamembraanvlekken.
- Kies het fluorescerende kanaal van de marker die wordt gebruikt om de celperiferie af te bakenen (phalloïden die corticale actine- of plasmamembraanmarkeringen zoals F4/80 labelen voor macrofaag, TCR-β voor T-cellen of cluster van differentiatie-cd-eiwitten die specifiek zijn voor subtypen immuuncellen).
- Stel de drempelwaarden in en geef een bereik van verwachte celgrootte (d.w.z. 1 tot 200 μm voor celdetectie).
- Voer de segmentatie uit. Een volume dat overeenkomt met de z-stack wordt gegenereerd met de gesegmenteerde cellen met een andere kleur voor elk van de aangrenzende cellen.
- Pas statistische filters (grootte, rondheid, circulariteit, enz.) toe op het tabblad statistiek om segmentatieartefacten uit te sluiten en/of om de gesegmenteerde cellen te verfijnen op de cel van rente op basis van hun grootte (d.w.z. 20-200 μm voor adipocyten; 5-25 μm voor macrofagen; 1-3 μm voor lymfocyten).
- Haal metingen en kwantitatieve gegevens (volume, getal, grootte, diameter, enz.) uit het tabblad statistieken.
- Segmentaire componenten (kernen, vesicles, enz.) of vaten als structuur.
OPMERKING: Hoewel de filamentsegmentatie erg handig is om de connectiviteit van de vaten te bestuderen, gebruiken we de segmentatie van de oppervlaktemodule om gegevens over de grootte, het volume en de diameters van de vaten te extraheren. De kwantificering van de afmetingen van de vaten gaat immers verloren bij het gebruik van de filamentenmodule.- Open de Surface-module van de software.
- Selecteer het fluorescerende kanaal van de markering die wordt gebruikt om de subcellulaire component specifiek te labelen om deze in 3D te reconstrueren.
- Stel de drempels in en geef een bereik van de verwachte diametergrootte van de structuur (d.w.z. 0,5-5 μm voor kernen; 0-100 μm voor schepen; enz.).
- Voer de segmentatie uit. Er wordt een volume met de gesegmenteerde cellulaire structuur gegenereerd. Metingen en kwantitatieve gegevens (volume, aantal, grootte, diameter, enz.) kunnen worden geëxtraheerd uit het tabblad statistieken.
- Segmenteer de schepen als een buisair continuüm.
OPMERKING: Hoewel de filamentsegmentatie erg handig is om de connectiviteit van de vaten te bestuderen, gebruiken we de segmentatie van de oppervlaktemodule om gegevens over de grootte, het volume en de diameters van de vaten te extraheren. De kwantificering van de afmetingen van de vaten gaat immers verloren bij het gebruik van de filamentenmodule.- Open de Filaments module van de software.
- Selecteer het fluorescerende kanaal dat overeenkomt met de kleuring van het vat.
- Stel de drempelwaarden in voor de fluorescentieintensiteit en selecteer het juiste aantal verwachte verbindingsknooppunten.
- Voer de segmentatie uit. Filamenten die het scheepsnetwerk vertegenwoordigen, worden in 3D gegenereerd. Metingen kunnen worden gehaald uit het tabblad statistieken, zodat kwantitatieve gegevens kunnen worden verkrijgt, waaronder de lengte van het vaartuig, het aantal vertakkingen van schepen, enz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de procedure hier beschreven en samengevat in figuur 1, waren we in staat om vlekken en optisch duidelijk menselijke en muis wit vetweefsel zoals gepresenteerd in figuur 2A en figuur 2B, respectievelijk. Het gerooide weefsel werd overgebracht naar de metalen beeldkamer om confocale beeldvorming uit te voeren(figuur 3A). De clearing drastisch verbeterd de diepte van het weefsel beelden die we in staat waren om te verwerven (Figuur 3B en Figuur 3C). Het hele vetweefsel kan worden verkregen in 3D bij een lage vergroting met behulp van een 4x doelstelling (zie Aanvullende Film 1), om een 3D-kaart te genereren, waardoor de verschillende gebieden te selecteren die moeten worden verworven bij een hoge vergroting met behulp van een 20x doelstelling (Figuur 3D). De hoge vergrotingsbeelden worden verkregen in 3D met een diepte van 2 mm (Figuur 3E).
Deze procedure maakt het mogelijk om talrijke algemene celmarkers te etiketteren, waaronder kernen met behulp van DAPI en actine door fluorescerend gelabeld phalloidin te gebruiken. Specifieke kleuring van lipidedruppels en adipocyten kan worden bereikt door het gebruik van perilipinantilichaam (zie tabel met materialen; Figuur 4A) en anti-Glut4-antilichaam (zie tabel met materialen; Figuur 4B) Respectievelijk. Bloedvaten kunnen worden gedetecteerd met behulp van het CD31-antilichaam (zie tabel met materialen; Figuur 4C) of door een intraveneuze injectie van lectine-DyLight649 kort voor het muisoffer (zie tabel met materialen; Figuur 4D). Macrofagen en T-cellen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van het anti-CD301-PhycoErythrin antilichaam (zie tabel met materialen; Figuur 4D) en het anti-TCR-β-Pacific Bleu-antilichaam (zie tabel met materialen; Figuur 4E). Het perifere zenuwnetwerk kan worden gedetecteerd met behulp van het anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) antilichaam (zie tabel met materialen; Figuur 4F-G). Bovendien maakt dit protocol het opruimen van epididyle vetweefsel van de muis mogelijk (figuur 4A-B,E),onderhuids vetweefsel van muizen(figuur 4D,G),muisbruin vetweefsel(figuur 4F)en menselijk vetweefsel(figuur 4C). Met behulp van een combinatie van deze etikettering en een commerciële software (zie tabel met materialen) om deze markers te segmenteren, kunnen we binnen het vetweefsel i) adipocyten gemiddelde grootte en grootteverdeling(figuur 5A-B) en ii) de dichtheid van het bloedvatnetwerk(figuur 5C)bepalen.
Figuur 1: Samenvatting van de clearingprocedure voor wit vetweefsel. Muis of menselijke witte vetweefsels worden bevestigd, permeabiliseerd, verzadigd, gekleurd en gewist. Beelden worden vervolgens verkregen in 3D en geanalyseerd met behulp van een commerciële software. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Foto's van wit vetweefsel. (A) Foto van menselijk wit abdominopelvic vetweefsel voor en na de clearingprocedure. (B) Foto van het epididymale witte vetweefsel van de muis vóór en na de clearingprocedure. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Verbeterde beeldvormingsdiepte met vetweefselclearing. (A) Montage van de metalen beeldkamer voorzien van glazen bodem. (B) Z-serie beelden van muis epididymal wit vetweefsel gekleurd met phalloidin-Alexa488 (groen) voor en na clearing. (C) XZ-projecties die overeenkomen met de witte stippellijnen over het paneel B z-stack. (D) Z-projectie van 0,4 cm z-stack van de muis onderhuids wit vetweefsel gekleurd voor actin met behulp van Phalloidin-Alexa488 en verworven bij een lage vergroting met een 4x doelstelling. De kleine afbeeldingen aan de rechterkant werden verworven op de geselecteerde weefselpositie met behulp van een 20x doelstelling. (E) Zijaanzicht van de 3D-volumeweergave van beeld z-stack van gerooid muiswit vetweefsel gekleurd met Phalloidin-Alexa488 op dezelfde manier verworven als de 20x beelden van (D). De 3D-beelddiepte die onze hoge vergrotingsprocedure bereikt, wordt hier gedemonstreerd en onderstreept door een z-diepte kleurcodering (donkerblauw voor z=0 mm tot donkerrood voor z=2 mm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Muis en menselijke witte vetweefsels gekleurd voor verschillende markers. (A) Enkel vlak beeld van muis epididymal wit vetweefsel gekleurd voor lipide druppels met behulp van anti-perilipin1 antilichaam en anti-muis-alexa647-geconjugeerd antilichaam. (B) Mozaïek enkelvlak beeld van muis epididymale witte vetweefsel gekleurd voor kernen en adipocyten met behulp van DAPI, anti-Glut4 antilichaam en anti-muis-alexa647-geconjugated antilichaam. (C) Z-projectie van 600 μm z-stack van menselijk wit abdominopelvic vetweefsel gekleurd voor vaten met cd31-alexa647-geconjugeerd antilichaam. (D) Z-projectie van 600 μm z-stack van de muis onderhuids wit vetweefsel gekleurd voor vaten en macrofagen met behulp van lectine-DyLight649 intraveneuze injecties en anti-CD301-alexa555 antilichaam. De inzet rechtsonder is een ingezoomde afbeelding van het wit stippelvak. (E) Een enkel vlak beeld van de muis epididymale witte vetweefsel gekleurd voor actine en T-cellen met behulp van phalloidin-Alexa488 en anti-TCRβ-Pacific blauw-geconjugeerd. De inzet rechtsonder is een ingezoomde afbeelding van het wit stippelvak. (F) Z-projectie van 50 μm z-stack van muisbruin vetweefsel gekleurd voor kernen en neuronale netwerk met behulp van DAPI, anti-TH antilichaam en anti-konijn-alexa647-geconjugeerd antilichaam. (G) Z-projectie van 600 μm z-stack van de muis onderhuids wit vetweefsel gekleurd voor kernen en neuronale netwerk met behulp van DAPI, anti-TH antilichaam en anti-konijn-alexa647-geconjugeerd antilichaam. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Analyse van 3D-beelden met behulp van commercieel beschikbare software (zie tabel met materialen). (A) 3D-volumeweergave van menselijke adipocyten gesegmenteerd in 3D door commercieel beschikbare software. Elke adipocyte heeft een andere kleur dan de contacterende aangrenzende adipocyten. Schepen zijn in het rood vertegenwoordigd. (B) Groottekwantificering en verdeling van de adipocyten van de 3D-volumeweergave van paneel A, die ongeveer 20.000 adipocyten bevat. (C) 3D-volumeweergave van bloedvaten gesegmenteerd in 3D met behulp van commercieel verkrijgde software en in rood of geel voor respectievelijk de grote en kleine vaten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende film 1: 3D-volumeweergave van het gehele onderhuidse witte vetweefsel dat in figuur 3Dwordt weergegeven . De witte doos vertegenwoordigt een kubus van 2 cm3. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De wijzigingen die zich voordoen in het vetweefsel in de loop van pathologische progressie, zoals die van obesitas, is fundamenteel voor het begrip van de mechanismen achter de pathologie. Baanbrekende studies die dergelijke mechanismen in vetweefsel aan het licht brachten, zijn gebaseerd op globale benaderingen zoals gehele vetweefselproteomics21, flow cytometrie22,23en transcriptomics24,25. Daarnaast zijn inspanningen geleverd om de structurele veranderingen in vetweefsel te onderzoeken aan de hand van histologische analyses26,27,28,29. Echter, de analyse van 5-10 μm vetweefsel secties, vanwege de beperkte omvang van de sectie, beperkt de mogelijkheid om belangrijke structurele kenmerken te waarderen. Ten eerste zijn slechts enkele adipocytenkernen per sectie detecteerbaar, aangezien elke sectie slechts een klein deel van de adipocyten vertegenwoordigt (1/10th). Ten tweede is de grootte van de adipocyten geschat op vetweefselsecties onjuist omdat de meeste adipocyten onder of achter hun evenaar worden gesneden, wat leidt tot een bevooroordeelde (onder)meting van hun gemiddelde grootte. Ten derde, het bloedvat en zenuwvezel continuüm gaan verloren tijdens fysieke sectie. Ten vierde is de verdeling van elke subtypes van immuuncellen in het weefsel moeilijk vast te stellen omdat de driedimensionale coördinaten verloren gaan. In deze context, de methodologie die wij hier voorstellen kan elk standaard laboratorium om mens en muis wit vetweefsel beeld in drie-dimensies, op een eenvoudige en goedkope manier.
Deze methode heeft wel een aantal beperkingen. Ten eerste is de tijd die nodig is om het weefsel voor te bereiden (fixatie, permeabilisatie, kleuring, clearing) lang (meer dan een week). Dit zou moeilijk te verminderen zijn omdat de meerderheid van deze tijd nodig is om het weefsel te bevlekken. De penetratie van antilichamen binnen dergelijke grote weefselmonsters vereist lange incubatietijden. Het verminderen van de incubatietijd zou het risico op niet-homogene antilichaam penetratie verhogen, wat zou leiden tot kleuring artefacten. Daarom is het enige mogelijke venster om tijd te winnen en de procedure te verkorten de tijd gewijd aan het weefsel te wissen, wat ongeveer een dag duurt wanneer optimale resultaten nodig zijn, maar dit kan worden teruggebracht tot een halve dag zonder een dramatische daling van de kwaliteit. De tweede beperking is de waarschijnlijke krimp van het weefsel. Inderdaad, in elk protocol dat weefsel uitdroogt met behulp van oplosmiddelen, is het waarschijnlijk dat de weefsels krimpen als gevolg van waterverwijdering. Het schatten van deze krimp is altijd een uitdaging, en het is hier bijna onmogelijk omdat de rand van het weefsel transparant wordt wanneer lipiden beginnen te worden geëxtraheerd tijdens het uitdrogingsproces. Daarom moeten de grootteschattingen van de gewiste weefsels met de nodige voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Het vergelijken van veranderingen in adipocytengrootte of vatlengte tussen weefsels afkomstig van muizen met verschillende genotypen en/of onderworpen aan verschillende milieuomstandigheden blijft echter informatief11. De laatste beperking is gekoppeld aan het grote volume van het hele vetweefsel van de muis of van een groot chirurgisch vetweefsel voor menselijke vetweefsel. Inderdaad, hoewel het protocol is perfect aangepast aan deze grote monsters duidelijk, imaging een heel orgaan is uitdagend met een confocale microscoop. De strategie om dit probleem te overwinnen en het volledige potentieel van de hele orgaanclearingprocedure te benutten, is het verkrijgen van een 3D-lage vergrotingskaart van het hele orgaan met behulp van een 4x-doelstelling, en om specifieke gebieden te selecteren die willekeurig verspreid zijn in het weefsel waar een hogere vergroting 3D-beelden met behulp van een 20x langeafstandsdoelstelling kunnen worden verworven. De "hoge vergroting" setup maakt het mogelijk beeldvorming van het weefsel volume van ongeveer 45 mm3 (4,7 x 4,7 x 2 mm). Hoewel dit volume beperkt is in vergelijking met het volume van het hele orgaan (0,5 tot meer dan 4 cm3),stelt het herhalen van de acquisities op verschillende posities in het weefsel ons in staat om een goede bemonstering van het weefsel te verkrijgen bij cellulaire tot subcellulaire resolutie. Merk op dat de beeldvorming van grote weefsels zal een aanzienlijke hoeveelheid beeldvorming gegevens die moeten worden opgeslagen genereren.
De procedure heeft aanzienlijke verschillen in vergelijking met methoden die eerder zijn beschreven om vetweefsel14,30tewissen . Allereerst, in tegenstelling tot AdipoClear, dat methanol, dichloormethaan en dibenzylether14gebruikt, gebruikt de hier gepresenteerde methode ethanol voor uitdroging en methyylzilcylaat voor clearing. Daarom is de procedure veiliger omdat het gebruik maakt van minder giftige clearing oplosmiddelen die vaak worden gebruikt door voedsel / drank-verwerkende industrie (ethanol en methylsalicylaat), in vergelijking met de hoge toxiciteit van dichloormethaan, methanol en dibenzylether. Bovendien is de bereiding van het weefsel volgens het protocol twee dagen sneller dan het AdipoClear-protocol14. Meer recent, een andere methode werd voorgesteld door Li en collega's om vetweefsel stukken duidelijk door ze onder te dompelen in glycerol30. Dit protocol is zeer eenvoudig, zelfs in vergelijking met deze procedure, en de kwaliteit van de beelden is goed, zelfs bij hoge vergroting. Dit clearingprotocol werkt echter alleen efficiënt bij het gebruik van 2 mm3 vetweefselstukken. De doorsnede van het weefsel in deze kleine monsters voorafgaand aan de clearing procedure voorkomt dat een beeldvorming weefsel volumes groter dan 2 mm3, zelfs bij een lage vergroting. De hier gepresenteerde procedure maakt het mogelijk om het hele weefsel in 3D bij lage vergroting en verwerving van 3D-stapels beelden rond 45 mm3 op verschillende bekende posities binnen het gehele gewiste vetweefsel bij hoge vergroting in kaart te brengen.
Deze procedure kan verschillende toekomstige toepassingen hebben. Zoals bij elke methode kan de hier beschreven procedure worden vereenvoudigd en/of verder worden geoptimaliseerd. Een interessante vooruitgang voor de procedure zou kunnen komen van de combinatie van het clearingproces, beschreven we, met extra imaging benaderingen. Specifieke beeldvormingsopstellingen, zoals Optical Projection Tomography (OPT), Total Internal Reflection Fluorescentie microscopie (TIRF), Selective Plan Illumination Microscopy (SPIM) of Stimulated Emission Depletion microscopie (STED) zijn in principe compatibel met de procedure, hoewel dit de toepasbaarheid ervan beperkt tot die laboratoria die zijn uitgerust met deze systemen. Als alternatief, met behulp van een doelstelling met een hoge numerieke diafragma-index en een overnamesysteem dat in staat is om honderden beelden per seconde te verwerven, die wordt gevonden in veel laboratoria, kan men super-resolutie analyses uit te voeren met behulp van de Super Resolution Radial Fluctuaties (SRRF) nabewerking beeldanalyse freeware31. Interessant is dat klassieke fluorchromen zijn aangepast voor de SRRF-analyse, die 3D-superresolutieanalyses van hele menselijke en muiswitte vetweefsels mogelijk zou maken.
Veel kritieke stappen in het protocol zijn gerelateerd aan de weefselverwerking voorafgaand aan de clearing zelf. Allereerst, en wat betreft klassieke histologische analyses, is de fixatiestap van fundamenteel belang. In het geval van zwakke fixatie blijven structurele kenmerken niet behouden, terwijl uitgebreide fixatie leidt tot crosslinking en blokkering van specifieke antigeenlocaties en bijgevolg niet-homogene immuno-kleuring. Een andere gevoelige stap is de kleuring van het weefsel, die een aantal kritische punten die we hieronder zullen beschrijven presenteert. Ten eerste moeten de antilichamen worden gevalideerd door ze te testen op cryostat-secties om te bevestigen dat ze functioneel zijn en om hun optimale concentratie te bepalen. De uiteindelijke concentratie die wordt gebruikt voor de clearing procedure is tien keer de optimale concentratie voor de cryostat secties. Ten tweede is het tijdstip van incubatie ook kritiek vanwege de grootte van het weefsel. Een te korte incubatietijd zal zwakke of niet-homogene immunosmeting veroorzaken (bijvoorbeeld correcte kleuring aan de periferie van het weefsel, maar geen interne kleuring). Op dezelfde manier, wassen stappen die te kort zijn zal voorkomen dat niet-specifiek gebonden antilichamen worden verwijderd uit het weefsel leidt tot niet-specifieke kleuring. Voor zover wij weten, heeft uitgebreide incubatie van het weefsel met antilichamen geen afbreuk aan de kleuring. Daarom raden we lange incubatie- en wasperiodes ten zeerste aan. Ten derde moet de keuze van het fluorchroom worden aangepast aan het signaal van belangstelling. In weefselmonsters in het algemeen, en vooral wit vetweefsel, is niet te verwaarlozen autofluorescentie detecteerbaar bij 488 nm en 555 nm. Voor sterk uitgedrukte eiwitten is dit geen probleem en de kleuring zal goed werken in deze kanalen. Echter, voor eiwitten met een lage expressie raden we het gebruik van ver-rode fluorchromen ten zeerste aan. Voor de clearing, zijn er geen kritische stappen, omdat de methodologie is zeer eenvoudig. Houd er rekening mee dat methyylsalicylaat niet compatibel is met kunststof materialen, daarom raden we glazen flessen aan voor de clearingstappen en een metalen kamer uitgerust met een glazen bodem om de beeldvorming uit te voeren. Alternatieven voor deze montage procedure bestaan met behulp van i) een normale glazen glijbaan, tand hars en glas coverslip (om een kleine glazen kamer te genereren), of ii) een glazen petrischaal (voor rechtopstaande microscoop opstellingen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door INSERM, Université Côte d'Azur, en door subsidies van het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR) via de Investments for the Future Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), het programma UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via Academy 2 "Systèmes Complex academie 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), en het Young Investigator Program naar J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). We danken ook de Imaging Core Facility van C3M gefinancierd door de Conseil Départemental des Alpes-Maritimes en de Région PACA, en die ook wordt ondersteund door het IBISA Microscopie en Imaging Platform Côte d'Azur (MICA). Wij danken Marion Dussot voor technische hulp bij weefselbereiding. Wij danken Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, voor het bewijs lezen van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes - Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes - Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software - IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
References
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
- Shields, K. J., Wu, C.
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W.
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
