अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा के ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की जांच के लिए समीपस्थ तरल पदार्थ का अलगाव
Summary
अग्नाशय का रस मानव अग्नाशय के कैंसर के लिए बायोमार्कर का एक कीमती स्रोत है। हम यहां इंट्राऑपरेटिव संग्रह प्रक्रिया के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। मुराइन मॉडल में इस प्रक्रिया को अपनाने की चुनौती को दूर करने के लिए, हम एक वैकल्पिक नमूना, ट्यूमर अंतरालीय तरल पदार्थ का सुझाव देते हैं, और इसके अलगाव के लिए यहां दो प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) कैंसर से संबंधित मृत्यु का चौथा प्रमुख कारण है, और जल्द ही दूसरा बनने वाला है। प्रीऑपरेटिव डिफरेंशियल डायग्नोसिस और रोगी प्रोफाइलिंग में मदद करने के लिए विशिष्ट अग्नाशयी विकृति से जुड़े चर की तत्काल आवश्यकता है। अग्नाशय का रस एक अपेक्षाकृत अस्पष्टीकृत शरीर का तरल पदार्थ है, जो ट्यूमर साइट के करीब निकटता के कारण, आसपास के ऊतक में परिवर्तन को दर्शाता है। यहां हम इंट्राऑपरेटिव संग्रह प्रक्रिया का विस्तार से वर्णन करते हैं। दुर्भाग्य से, यांत्रिक अध्ययन करने के लिए पीडीएसी के मुराइन मॉडल में अग्नाशय के रस संग्रह का अनुवाद करना तकनीकी रूप से बहुत चुनौतीपूर्ण है। ट्यूमर अंतरालीय द्रव (टीआईएफ) रक्त और प्लाज्मा के बाहर बाह्य तरल पदार्थ है, जो ट्यूमर और स्ट्रोमल कोशिकाओं को स्नान करता है। अग्नाशय के रस के समान, प्लाज्मा में पतला पाए जाने वाले अणुओं को इकट्ठा करने और केंद्रित करने के लिए इसकी संपत्ति के लिए, टीआईएफ का उपयोग माइक्रोएन्वायरमेंटल परिवर्तनों के संकेतक के रूप में और रोग से जुड़े बायोमाकर्स के मूल्यवान स्रोत के रूप में किया जा सकता है। चूंकि टीआईएफ आसानी से सुलभ नहीं है, इसलिए इसके अलगाव के लिए विभिन्न तकनीकों का प्रस्ताव किया गया है। हम यहां इसके अलगाव के लिए दो सरल और तकनीकी रूप से अवांछित तरीकों का वर्णन करते हैं: ऊतक सेंट्रीफ्यूजेशन और ऊतक क्षालन।
Introduction
अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) सबसे आक्रामक ट्यूमर में से एक है, और जल्द ही मृत्यु का दूसरा प्रमुख कारण बन जाएगा 1,2,3. यह अपने इम्यूनोसप्रेसिव माइक्रोएन्वायरमेंट के लिए और इम्यूनोथेरेपी प्रोटोकॉल 4 के प्रति अपनी अनुक्रियाशीलता के लिए अच्छी तरह से जाना जाताहै। वर्तमान में, सर्जिकल रिसेक्शन अभी भी पीडीएसी के लिए एकमात्र उपचारात्मक विकल्प है, फिर भी शुरुआती रिलैप्स और पोस्टसर्जिकल जटिलताओं की उच्च आवृत्ति है। एक उन्नत चरण तक विशिष्ट लक्षणों की कमी प्रारंभिक निदान की अनुमति नहीं देती है, जो रोग की समय सीमा में योगदान देती है। इसके अलावा, पीडीएसी और अन्य सौम्य अग्नाशयी विकृति के बीच लक्षणों का ओवरलैप वर्तमान नैदानिक रणनीतियों के साथ एक त्वरित और विश्वसनीय निदान की उपलब्धि में बाधा डाल सकता है। विशिष्ट अग्नाशयी विकृति से जुड़े चर की पहचान सर्जिकल निर्णय लेने की प्रक्रिया को सुविधाजनक बना सकती है और रोगी प्रोफाइलिंग में सुधार कर सकती है।
बायोमार्कर खोज में आशाजनक परिणाम आसानी से सुलभ शरीर के तरल पदार्थों का उपयोग करके प्राप्त किए गए हैं, जैसे रक्त 5,6,7, मूत्र8, लार9 और अग्नाशय का रस 10,11,12। कई अध्ययनों ने व्यापक “ओमिक्स” दृष्टिकोणों का शोषण किया है, जैसे कि जीनोमिक, प्रोटिओमिक और मेटाबोलिक तकनीक, उम्मीदवार अणुओं या हस्ताक्षरों की पहचान करने के लिए जो पीडीएसी और अन्य सौम्य अग्नाशयी पीड़ाओं के बीच भेदभाव कर सकते हैं। हमने हाल ही में प्रदर्शित किया कि अग्नाशय का रस, एक अपेक्षाकृत अस्पष्टीकृत शरीर का तरल पदार्थ, का उपयोग अलग-अलग नैदानिक प्रोफाइलवाले रोगियों के चयापचय हस्ताक्षर की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। अग्नाशय का रस एक प्रोटीन युक्त तरल पदार्थ है, जो अग्नाशयी डक्टल कोशिकाओं के स्राव को जमा करता है और मुख्य अग्नाशय वाहिनी में बहता है, और फिर मुख्य सामान्य पित्त नली में। अग्न्याशय से इसकी निकटता के कारण, यह ट्यूमर द्रव्यमान (चित्रा 1) द्वारा प्रेरित माइक्रोएन्वायरमेंटल गड़बड़ी से दृढ़ता से प्रभावित हो सकता है, और इसलिए रक्त या मूत्र, या ऊतक-आधारित प्रोफाइलिंग की तुलना में अधिक जानकारीपूर्ण हो सकता है। कई अध्ययनों ने विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग करके रोग के नए बायोमाकर्स की पहचान करने के लिए अग्नाशय के रस की क्षमता का पता लगाया है, जिसमें साइटोलॉजिकल विश्लेषण13, मास-स्पेक्ट्रोमेट्री14,15 द्वारा किए गए प्रोटिओमिक विश्लेषण, आनुवंशिक और एपिजेनेटिक मार्करों जैसे के-रास और पी 53 उत्परिवर्तन16,17, डीएनए मिथाइलेशन 18 में परिवर्तन, और एमआईआरएनए19 शामिल हैं। . तकनीकी रूप से, अग्नाशय के रस को इंट्राऑपरेटिव रूप से या न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रियाओं के साथ एकत्र किया जा सकता है, जैसे कि एंडोस्कोपिक अल्ट्रासाउंड, प्रतिगामी कोलेंजियो-अग्नाशयोग्राफी, या ग्रहणी रस स्राव20 के एंडोस्कोपिक संग्रह द्वारा। यह अभी तक स्पष्ट नहीं है कि उपयोग की जाने वाली संग्रह तकनीक से अग्नाशय के रस की संरचना किस हद तक प्रभावित होती है। हम यहां इंट्राऑपरेटिव संग्रह प्रक्रिया का वर्णन करते हैं और दिखाते हैं कि अग्नाशय का रस पीडीएसी बायोमाकर्स के लिए एक कीमती स्रोत का प्रतिनिधित्व कर सकता है।
चित्रा 1: अग्नाशय के रस संग्रह का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) अग्नाशयी नलिका में अग्नाशय के रस के स्राव और सर्जरी के दौरान इसके संग्रह को दर्शाने वाला योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। इनसेट ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का क्लोज-अप दिखाता है: अग्नाशय का रस अग्नाशयी नलिकाओं में ट्यूमर और स्ट्रोमल कोशिकाओं द्वारा जारी अणुओं को इकट्ठा करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पीडीएसी के आनुवंशिक और ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल में अग्नाशय के रस के संग्रह को प्रीक्लिनिकल यांत्रिक अध्ययनों में इस बायोफ्लुइड का फायदा उठाने के परिप्रेक्ष्य में सराहना की जाएगी; हालांकि, यह प्रक्रिया तकनीकी रूप से बहुत चुनौतीपूर्ण हो सकती है और चमड़े के नीचे के ट्यूमर जैसे सरल मॉडल के लिए संभव नहीं है। इस कारण से, हमने ट्यूमर इंटरस्टीशियल द्रव (टीआईएफ) को अग्नाशय के रस के वैकल्पिक स्रोत के रूप में पहचाना, इसकी समान विशेषता के लिए आसपास के गड़बड़ी के संकेतक के रूप में कार्य करना। अंतरालीय द्रव (आईएफ) बाह्य तरल है, जो रक्त और लसीका वाहिकाओं के बाहर पाया जाता है, जो ऊतक कोशिकाओं को स्नान करताहै। यदि संरचना अंग और स्थानीय स्राव दोनों में रक्त परिसंचरण से प्रभावित होती है; वास्तव में, आसपास की कोशिकाएं सक्रिय रूप से आईएफ21 में प्रोटीन का उत्पादन और स्राव करती हैं। इंटरस्टिटियम आसपास के ऊतकों के सूक्ष्म पर्यावरणीय परिवर्तनों को दर्शाता है और इसलिए ट्यूमर जैसे कई पैथोलॉजिकल संदर्भों में बायोमार्कर खोज के लिए एक मूल्यवान स्रोत का प्रतिनिधित्व कर सकता है। टीआईएफ में स्थानीय रूप से स्रावित प्रोटीन की उच्च सांद्रता का उपयोग प्लाज्मा 22,23,24 में रोगसूचक या नैदानिक बायोमार्करके रूप में परीक्षण किए जाने वाले उम्मीदवार अणुओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। कई अध्ययनों ने टीआईएफ को उच्च-थ्रूपुट प्रोटिओमिक दृष्टिकोणों के लिए एक उपयुक्त नमूना साबित किया है, जैसे कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक 23,24,25, साथ ही मल्टीप्लेक्स एलिसा दृष्टिकोण26, और माइक्रोआरएनए प्रोफाइलिंग27।
ट्यूमर में आईएफ के अलगाव के लिए कई दृष्टिकोण प्रस्तावित किए गए हैं, जिन्हें मोटे तौर पर विवो (केशिका अल्ट्राफिल्ट्रेशन 28,29,30,31 और माइक्रोडायलिसिस 32,33,34,35) और एक्स विवो विधियों (ऊतक सेंट्रीफ्यूजेशन 22,36,37,38 और ऊतक सेंट्रीफ्यूजेशन22,36,37,38) के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। ऊतक क्षालन 39,40,41,42)। इन तकनीकों कीव्यापक विस्तार से समीक्षा की गई है। उपयुक्त विधि की पसंद को डाउनस्ट्रीम विश्लेषण और अनुप्रयोगों और पुनर्प्राप्त मात्रा जैसे मुद्दों को ध्यान में रखना चाहिए। हमने हाल ही में इस दृष्टिकोण का उपयोग सिद्धांत के प्रमाण के रूप में किया ताकि दो मुराइन अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा सेललाइनों 12 से ट्यूमर की विभिन्न चयापचय गतिविधि को प्रदर्शित किया जा सके। साहित्य24,38 के आधार पर, हमने सेल टूटने और इंट्रासेल्युलर सामग्री से कमजोर पड़ने से बचने के लिए कम गति सेंट्रीफ्यूजेशन विधि का उपयोग करना चुना। टीआईएफ में ग्लूकोज और लैक्टेट दोनों की मात्रा दो अलग-अलग सेल लाइनों की विभिन्न ग्लाइकोलाइटिक विशेषताओं को दर्शाती है। यहां हम टीआईएफ के अलगाव के लिए दो सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले तरीकों के प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं: ऊतक सेंट्रीफ्यूजेशन और ऊतक क्षालन (चित्रा 2)।
चित्रा 2: ट्यूमर अंतरालीय द्रव अलगाव विधियों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित तकनीकों का योजनाबद्ध चित्रण, अर्थात् ऊतक सेंट्रीफ्यूजेशन (ए) और ऊतक क्षालन (बी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में हमने अग्नाशय के रस को इंट्राऑपरेटिव रूप से इकट्ठा करने की तकनीक का वर्णन किया है, जो काफी हद तक अस्पष्टीकृत द्रव बायोप्सी है। हमने हाल ही में दिखाया है कि अग्नाशय के रस का उपयोग रोग12<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए रॉबर्टा मिगलियोर को धन्यवाद देते हैं। इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान को IG2016-ID.18443 परियोजना – P.I. Marchesi Federica के तहत Associazione इटालियाना पर la ricerca sul cancro (AIRC) से धन प्राप्त हुआ है। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।
Materials
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Greiner BioOne | GR616201 | |
| 20 µm nylon cell strainer | pluriSelect | 43-50020-03 | |
| 25G needle | BD Biosciences | 305122 | |
| 3 mL K2EDTA vacutainer | BD Biosciences | 366473 | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309656 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Clamps | Medicon | 06.20.12 | |
| Disposable scalpel | Medicom | 9000-10 | |
| Fetal bovine serum | Microtech | MG10432 | |
| Flat-tipped forceps | Medicon | 06.00.10 | |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | ECB3001D | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 34044100 | |
| RPMI medium | Euroclone | ECB9006L | |
| Scissors | Medicon | 02.04.09 | |
| Trypsin/EDTA 1x | Lonza | BE17-161F | |
| Ultraglutamine 100x | Lonza | BE17-605E/U1 |
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