Bukspottkörteljuice är en värdefull källa till biomarkörer för human bukspottkörtelcancer. Vi beskriver här en metod för intraoperativ insamlingsprocedur. För att övervinna utmaningen att anta denna procedur i murina modeller föreslår vi ett alternativt prov, tumörinterstitiell vätska, och beskriver här två protokoll för dess isolering.
Pankreas adenokarcinom (PDAC) är den fjärde ledande orsaken till cancerrelaterad död och snart den andra. Det finns ett akut behov av variabler associerade med specifika pankreaspatologier för att hjälpa preoperativ differentialdiagnos och patientprofilering. Bukspottkörteljuice är en relativt outforskad kroppsvätska, som på grund av sin närhet till tumörstället återspeglar förändringar i den omgivande vävnaden. Här beskriver vi i detalj det intraoperativa insamlingsförfarandet. Tyvärr är det tekniskt mycket utmanande att översätta pankreasjuicesamling till murina modeller av PDAC, för att utföra mekanistiska studier. Tumörinterstitiell vätska (TIF) är den extracellulära vätskan, utanför blod och plasma, som badar tumör- och stromaceller. På samma sätt som bukspottkörteljuice, för dess egenskap att samla och koncentrera molekyler som finns utspädda i plasma, kan TIF utnyttjas som en indikator på mikromiljöförändringar och som en värdefull källa till sjukdomsassocierade biomarkörer. Eftersom TIF inte är lättillgängligt har olika tekniker föreslagits för dess isolering. Vi beskriver här två enkla och tekniskt krävande metoder för dess isolering: vävnadscentrifugering och vävnadsel.
Pankreatiskt duktalt adenokarcinom (PDAC) är en av de mest aggressiva tumörerna och kommer snart att bli den näst vanligaste dödsorsaken 1,2,3. Det är välkänt för sin immunsuppressiva mikromiljö och för sin svarslöshet på immunterapiprotokoll4. För närvarande är kirurgisk resektion fortfarande det enda botande alternativet för PDAC, men det finns en hög frekvens av tidiga återfall och posturgiska komplikationer. Bristen på specifika symtom tills ett avancerat stadium tillåter inte en tidig diagnos, vilket bidrar till sjukdomens tidsfrister. Dessutom kan överlappningen av symtom mellan PDAC och andra godartade pankreaspatologier hindra uppnåendet av en snabb och tillförlitlig diagnos med de nuvarande diagnostiska strategierna. Identifieringen av variabler associerade med specifika pankreaspatologier kan underlätta den kirurgiska beslutsprocessen och förbättra patientprofilering.
Lovande resultat i biomarkörupptäckt har uppnåtts med hjälp av lättillgängliga kroppsvätskor, såsom blod 5,6,7, urin8, saliv 9 och bukspottkörteljuice10,11,12. Många studier har utnyttjat omfattande “omics” -metoder, såsom genomiska, proteomiska och metabolomiska tekniker, för att identifiera kandidatmolekyler eller signaturer som kan skilja mellan PDAC och andra godartade bukspottkörtelbesvär. Vi visade nyligen att bukspottkörteljuice, en relativt outforskad kroppsvätska, kan användas för att identifiera metaboliska signaturer hos patienter med distinkta kliniska profiler12. Bukspottkörteljuice är en proteinrik vätska som ackumulerar sekretomet hos bukspottkörtelkanalceller och strömmar till huvudkanalen i bukspottkörteln och sedan till den huvudsakliga gemensamma gallkanalen. På grund av dess närhet till bukspottkörteln kan den påverkas starkt av mikromiljöstörningar inducerade av tumörmassan (figur 1) och därför mer informativ än blod eller urin eller vävnadsbaserad profilering. Flera studier har undersökt potentialen hos bukspottkörteljuice för att identifiera nya biomarkörer för sjukdom med hjälp av olika tillvägagångssätt, inklusive cytologisk analys 13, proteomisk analys utförd med masspektrometri 14,15, bedömning av genetiska och epigenetiska markörer såsom K-ras och p53-mutationer 16,17, förändringar i DNA-metylering18 och miRNA 19 . Tekniskt sett kan bukspottkörteljuice samlas intraoperativt eller med minimalt invasiva procedurer, såsom endoskopisk ultraljud, retrograd kolangio-pankreatografi eller genom endoskopisk insamling av duodenal juicesekretion20. Det är ännu inte klart i vilken utsträckning bukspottskörteljuicekompositionen påverkas av den använda insamlingstekniken. Vi beskriver här det intraoperativa insamlingsförfarandet och visar att bukspottkörteljuice kan utgöra en värdefull källa för PDAC-biomarkörer.
Figur 1: Schematisk representation av pankreasjuice samling. (A) Schematisk representation som visar utsöndringen av bukspottkörteljuice i bukspottkörtelkanalen och dess samling under operationen. Insatsen visar en närbild av tumörmikromiljön: bukspottkörteljuice samlar molekyler som frigörs av tumör- och stromaceller i bukspottkörtelkanalerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Insamlingen av bukspottkörteljuice i genetiska och ortotopiska musmodeller av PDAC skulle uppskattas i perspektivet att utnyttja denna biofluid i prekliniska mekanistiska studier; Denna procedur kan dock vara tekniskt mycket utmanande och är inte genomförbar för enklare modeller som subkutana tumörer. Av denna anledning identifierade vi tumörinterstitiell vätska (TIF) som en alternativ källa till bukspottkörteljuice, för dess liknande egenskap att fungera som en indikator på omgivande störningar. Interstitiell vätska (IF) är den extracellulära vätskan, som finns utanför blod och lymfkärl, som badar vävnadsceller21. IF-kompositionen påverkas av både blodcirkulationen till organet och lokal utsöndring; i själva verket producerar och utsöndrar omgivande celler aktivt proteiner i IF21. Interstitium återspeglar mikromiljöförändringar i omgivande vävnader och kan därför utgöra en värdefull källa för biomarkörupptäckt i flera patologiska sammanhang, såsom tumörer. Den höga koncentrationen av lokalt utsöndrade proteiner i TIF kan användas för att identifiera kandidatmolekyler som ska testas som prognostiska eller diagnostiska biomarkörer i plasma22,23,24. Flera studier har visat att TIF är ett lämpligt prov för proteomiska metoder med hög genomströmning, såsom masspektrometritekniker 23,24,25, samt multiplex ELISA-tillvägagångssätt 26 och mikroRNA-profilering 27.
Flera tillvägagångssätt har föreslagits för isolering av IF i tumörer, som i stort sett kan kategoriseras som de vivo (kapillär ultrafiltrering 28,29,30,31 och mikrodialys 32,33,34,35) och ex vivo-metoder (vävnadscentrifugering 22,36,37,38 och vävnadseluering 39,40,41,42). Dessa tekniker har granskats i detalj43,44. Vid valet av lämplig metod bör hänsyn tas till frågor som analyser och tillämpningar i senare led och den återvunna volymen. Vi använde nyligen detta tillvägagångssätt som ett principbevis för att visa den olika metaboliska aktiviteten hos tumörer från två murina pankreas adenokarcinomcellinjer12. Baserat på litteratur 24,38 valde vi att använda låghastighetscentrifugeringsmetoden för att undvika cellbrott och utspädning från intracellulärt innehåll. Både mängden glukos och laktat i TIF återspeglade de olika glykolytiska egenskaperna hos de två olika cellinjerna. Här beskriver vi i detalj protokollet för de två vanligaste metoderna för isolering av TIF: vävnadscentrifugering och vävnadseluering (figur 2).
Figur 2: Schematisk representation av tumörinterstitiella vätskeisoleringsmetoder. Schematisk illustration av de tekniker som beskrivs i detalj i protokollet, nämligen vävnadscentrifugering (A) och vävnadsel (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
I denna studie har vi beskrivit tekniken för att intraoperativt samla bukspottkörteljuice, en i stort sett outforskad vätskebiopsi. Vi har nyligen visat att bukspottkörteljuice kan utnyttjas som en källa till metaboliska markörer för sjukdom12. Metabolomisk analys på andra flytande biopsier, såsom blod 5,6,7, urin8 och saliv9, har visat lovande resu…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Roberta Migliore för tekniskt stöd. Forskningen som leder till dessa resultat har fått finansiering från Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) under IG2016-ID.18443-projektet – PI Marchesi Federica. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förberedelse av manuskriptet.
1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
1.5 mL Eppendorf tube | Greiner BioOne | GR616201 | |
20 µm nylon cell strainer | pluriSelect | 43-50020-03 | |
25G needle | BD Biosciences | 305122 | |
3 mL K2EDTA vacutainer | BD Biosciences | 366473 | |
3 mL syringe | BD Biosciences | 309656 | |
50 mL Falcon tube | Corning | 352098 | |
Clamps | Medicon | 06.20.12 | |
Disposable scalpel | Medicom | 9000-10 | |
Fetal bovine serum | Microtech | MG10432 | |
Flat-tipped forceps | Medicon | 06.00.10 | |
Penicillin-Streptomycin | Lonza | ECB3001D | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 34044100 | |
RPMI medium | Euroclone | ECB9006L | |
Scissors | Medicon | 02.04.09 | |
Trypsin/EDTA 1x | Lonza | BE17-161F | |
Ultraglutamine 100x | Lonza | BE17-605E/U1 |