Isolamento de Fluidos Proximais para Investigar o Microambiente Tumoral do Adenocarcinoma Pancreático

Summary

O suco pancreático é uma fonte preciosa de biomarcadores para o câncer de pâncreas humano. Descrevemos aqui um método para o procedimento de coleta intraoperatória. Para superar o desafio de adotar esse procedimento em modelos murinos, sugerimos uma amostra alternativa, o líquido intersticial tumoral, e descrevemos aqui dois protocolos para seu isolamento.

Abstract

O adenocarcinoma pancreático (PDAC) é a quarta principal causa de morte relacionada ao câncer e logo se tornará a segunda. Há uma necessidade urgente de variáveis associadas a patologias pancreáticas específicas para auxiliar o diagnóstico diferencial pré-operatório e o perfil do paciente. O suco pancreático é um fluido corporal relativamente inexplorado, que, devido à sua proximidade com o local do tumor, reflete mudanças no tecido circundante. Aqui descrevemos detalhadamente o procedimento de coleta intraoperatória. Infelizmente, traduzir a coleta de suco pancreático para modelos murinos de PDAC, para realizar estudos mecanicistas, é tecnicamente muito desafiador. O líquido intersticial tumoral (TIF) é o fluido extracelular, fora do sangue e do plasma, que banha as células tumorais e estromais. Da mesma forma que o suco pancreático, por sua propriedade de coletar e concentrar moléculas que são encontradas diluídas no plasma, o TIF pode ser explorado como um indicador de alterações microambientais e como uma valiosa fonte de biomarcadores associados à doença. Como o TIF não é facilmente acessível, várias técnicas têm sido propostas para o seu isolamento. Descrevemos aqui dois métodos simples e tecnicamente pouco exigentes para o seu isolamento: centrifugação tecidual e eluição tecidual.

Introduction

O adenocarcinoma ductal pancreático (ACPD) é um dos tumores mais agressivos, e logo se tornará a segunda principal causa de morte ^1,2,3. É conhecida por seu microambiente imunossupressor e por sua falta de resposta aos protocolos de imunoterapia⁴. Atualmente, a ressecção cirúrgica ainda é a única opção curativa para a ACPD, mas há uma alta frequência de recidivas precoces e complicações pós-cirúrgicas. A falta de sintomas específicos até um estágio avançado não permite um diagnóstico precoce, contribuindo para os prazos da doença. Além disso, a sobreposição de sintomas entre o PDAC e outras patologias pancreáticas benignas pode dificultar a obtenção de um diagnóstico rápido e confiável com as estratégias diagnósticas atuais. A identificação de variáveis associadas a patologias pancreáticas específicas poderia facilitar o processo de tomada de decisão cirúrgica e melhorar o perfil do paciente.

Resultados promissores na descoberta de biomarcadores têm sido alcançados utilizando fluidos corporais de fácil acesso, como sangue ^5,6,7, urina⁸, saliva 9 e suco pancreático^10,11,12. Muitos estudos exploraram abordagens “ômicas” abrangentes, como técnicas genômicas, proteômicas e metabolômicas, para identificar moléculas ou assinaturas candidatas que poderiam discriminar entre PDAC e outras aflições pancreáticas benignas. Recentemente, demonstramos que o suco pancreático, um fluido corporal relativamente inexplorado, pode ser utilizado para identificar assinaturas metabólicas de pacientes com perfis clínicos distintos¹². O suco pancreático é um fluido rico em proteínas, que acumula o secretoma das células ductais pancreáticas e flui para o ducto pancreático principal e, em seguida, para o ducto biliar comum principal. Devido à sua proximidade com o pâncreas, pode ser fortemente afetada por perturbações microambientais induzidas pela massa tumoral (Figura 1) e, portanto, mais informativa do que o sangue ou a urina, ou o perfil baseado em tecidos. Vários estudos têm explorado o potencial do suco pancreático para identificar novos biomarcadores de doença usando várias abordagens, incluindo análise citológica 13, análise proteômica realizada por espectrometria de massa^14,15, avaliação de marcadores genéticos e epigenéticos como mutações K-ras e p53 ^16,17, alterações na metilação do DNA 18 e miRNAs ¹⁹ . Tecnicamente, o suco pancreático pode ser coletado no intraoperatório ou com procedimentos minimamente invasivos, como ultrassonografia endoscópica, colangiopancreatografia retrógrada ou por coleta endoscópica de secreção de suco duodenal²⁰. Ainda não está claro até que ponto a composição do suco pancreático é afetada pela técnica de coleta utilizada. Descrevemos aqui o procedimento de coleta intraoperatória e mostramos que o suco pancreático pode representar uma fonte preciosa de biomarcadores PDAC.

Figura 1: Representação esquemática da coleção de suco pancreático. (A) Representação esquemática que descreve a secreção de suco pancreático no ducto pancreático e sua coleta durante a cirurgia. A inserção mostra um close-up do microambiente tumoral: o suco pancreático coleta moléculas liberadas por células tumorais e estromais nos ductos pancreáticos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A coleta de suco pancreático em modelos genéticos e ortotópicos de camundongos de PDAC seria apreciada na perspectiva de explorar esse biofluido em estudos mecanicistas pré-clínicos; no entanto, esse procedimento pode ser tecnicamente muito desafiador e inviável para modelos mais simples, como tumores subcutâneos. Por esse motivo, identificamos o líquido intersticial tumoral (TIF) como uma fonte alternativa ao suco pancreático, por sua característica semelhante de atuar como um indicador de perturbações circundantes. O líquido intersticial (FI) é o líquido extracelular, encontrado fora dos vasos sanguíneos e linfáticos, que banha as células teciduais²¹. A composição do FI é afetada tanto pela circulação sanguínea para o órgão quanto pela secreção local; de fato, as células circundantes produzem e secretam ativamente proteínas no FI²¹. O interstício reflete as alterações microambientais dos tecidos circundantes e, portanto, pode representar uma fonte valiosa para a descoberta de biomarcadores em vários contextos patológicos, como tumores. A alta concentração de proteínas secretadas localmente no TIF pode ser utilizada para identificar moléculas candidatas a serem testadas como biomarcadores prognósticos ou diagnósticos no plasma^22,23,24. Vários estudos comprovaram que o TIF é uma amostra adequada para abordagens proteômicas de alto rendimento, como técnicas de espectrometria de massa 23,24,25^, bem como abordagens ELISA multiplex 26 e perfil de microRNA ²⁷.

Diversas abordagens têm sido propostas para o isolamento do FI em tumores, que podem ser amplamente categorizados como in vivo (ultrafiltração capilar 28,29,30,31 e microdiálise 32,33,34,35) e métodos ex vivo (centrifugação tecidual ^22,36,37,38 e eluição tecidual 39,40,41,42). Essas técnicas têm sido revisadas em detalhes^{extensivos 43,44}. A escolha do método adequado deverá ter em conta questões como as análises e aplicações a jusante e o volume recuperado. Recentemente, utilizamos essa abordagem como prova de princípio para demonstrar a diferente atividade metabólica de tumores de duas linhagens celulares de adenocarcinoma pancreático murino¹². Com base na literatura^24,38, optou-se por utilizar o método de centrifugação de baixa velocidade para evitar a quebra celular e a diluição do conteúdo intracelular. Tanto a quantidade de glicose quanto o lactato no TIF refletiram as diferentes características glicolíticas das duas linhagens celulares diferentes. Aqui descrevemos detalhadamente o protocolo para os dois métodos mais utilizados para o isolamento de TIF: centrifugação tecidual e eluição tecidual (Figura 2).

Figura 2: Representação esquemática dos métodos de isolamento do líquido intersticial tumoral. Ilustração esquemática das técnicas descritas detalhadamente no protocolo, nomeadamente centrifugação tecidual (A) e eluição tecidual (B). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Para todos os pacientes inscritos, o sangue periférico e o suco pancreático foram coletados no momento da cirurgia, de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Ética da Instituição. Todos os pacientes foram incluídos no estudo após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, incluindo coleta de espécimes biológicos e dados clínicos. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Instituição (protocolo número ICH-595, aprovação emitida em maio de 2009). Os procedimentos envolvendo camu…

Representative Results

Seguimos o procedimento descrito acima para obtenção de suco pancreático de pacientes com PCAC (n=31) e outras aflições pancreáticas benignas (não PDAC, n=9), incluindo pancreatite (n=2), tumores papilar-ampola (n=4), tumores neuroendócrinos (n=2), neoplasia mucinosa papilar intraductal (NMPI; n=1)12. As amostras de suco pancreático foram então submetidas à análise metabolômica por ressonância magnética nuclear (1H-NMR)12. Ao filtrar o…

Discussion

Neste estudo, descrevemos a técnica de coleta intraoperatória de suco pancreático, uma biópsia de fluidos em grande parte inexplorada. Recentemente, mostramos que o suco pancreático pode ser explorado como fonte de marcadores metabólicos da doença¹². A análise metabolômica em outras biópsias líquidas, como sangue ^5,6,7, urina⁸ e saliva^9, mostrou r…

Materials

1 mL syringe	BD Biosciences	309659
1.5 mL Eppendorf tube	Greiner BioOne	GR616201
20 µm nylon cell strainer	pluriSelect	43-50020-03
25G needle	BD Biosciences	305122
3 mL K2EDTA vacutainer	BD Biosciences	366473
3 mL syringe	BD Biosciences	309656
50 mL Falcon tube	Corning	352098
Clamps	Medicon	06.20.12
Disposable scalpel	Medicom	9000-10
Fetal bovine serum	Microtech	MG10432
Flat-tipped forceps	Medicon	06.00.10
Penicillin-Streptomycin	Lonza	ECB3001D
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Protease inhibitor cocktail	Roche	34044100
RPMI medium	Euroclone	ECB9006L
Scissors	Medicon	02.04.09
Trypsin/EDTA 1x	Lonza	BE17-161F
Ultraglutamine 100x	Lonza	BE17-605E/U1