Isolering av proximala vätskor för att undersöka tumörmikromiljön i bukspottskörtelns adenokarcinom

Summary

Bukspottkörteljuice är en värdefull källa till biomarkörer för human bukspottkörtelcancer. Vi beskriver här en metod för intraoperativ insamlingsprocedur. För att övervinna utmaningen att anta denna procedur i murina modeller föreslår vi ett alternativt prov, tumörinterstitiell vätska, och beskriver här två protokoll för dess isolering.

Abstract

Pankreas adenokarcinom (PDAC) är den fjärde ledande orsaken till cancerrelaterad död och snart den andra. Det finns ett akut behov av variabler associerade med specifika pankreaspatologier för att hjälpa preoperativ differentialdiagnos och patientprofilering. Bukspottkörteljuice är en relativt outforskad kroppsvätska, som på grund av sin närhet till tumörstället återspeglar förändringar i den omgivande vävnaden. Här beskriver vi i detalj det intraoperativa insamlingsförfarandet. Tyvärr är det tekniskt mycket utmanande att översätta pankreasjuicesamling till murina modeller av PDAC, för att utföra mekanistiska studier. Tumörinterstitiell vätska (TIF) är den extracellulära vätskan, utanför blod och plasma, som badar tumör- och stromaceller. På samma sätt som bukspottkörteljuice, för dess egenskap att samla och koncentrera molekyler som finns utspädda i plasma, kan TIF utnyttjas som en indikator på mikromiljöförändringar och som en värdefull källa till sjukdomsassocierade biomarkörer. Eftersom TIF inte är lättillgängligt har olika tekniker föreslagits för dess isolering. Vi beskriver här två enkla och tekniskt krävande metoder för dess isolering: vävnadscentrifugering och vävnadsel.

Introduction

Pankreatiskt duktalt adenokarcinom (PDAC) är en av de mest aggressiva tumörerna och kommer snart att bli den näst vanligaste dödsorsaken ^1,2,3. Det är välkänt för sin immunsuppressiva mikromiljö och för sin svarslöshet på immunterapiprotokoll⁴. För närvarande är kirurgisk resektion fortfarande det enda botande alternativet för PDAC, men det finns en hög frekvens av tidiga återfall och posturgiska komplikationer. Bristen på specifika symtom tills ett avancerat stadium tillåter inte en tidig diagnos, vilket bidrar till sjukdomens tidsfrister. Dessutom kan överlappningen av symtom mellan PDAC och andra godartade pankreaspatologier hindra uppnåendet av en snabb och tillförlitlig diagnos med de nuvarande diagnostiska strategierna. Identifieringen av variabler associerade med specifika pankreaspatologier kan underlätta den kirurgiska beslutsprocessen och förbättra patientprofilering.

Lovande resultat i biomarkörupptäckt har uppnåtts med hjälp av lättillgängliga kroppsvätskor, såsom blod ^5,6,7, urin⁸, saliv 9 och bukspottkörteljuice^10,11,12. Många studier har utnyttjat omfattande “omics” -metoder, såsom genomiska, proteomiska och metabolomiska tekniker, för att identifiera kandidatmolekyler eller signaturer som kan skilja mellan PDAC och andra godartade bukspottkörtelbesvär. Vi visade nyligen att bukspottkörteljuice, en relativt outforskad kroppsvätska, kan användas för att identifiera metaboliska signaturer hos patienter med distinkta kliniska profiler¹². Bukspottkörteljuice är en proteinrik vätska som ackumulerar sekretomet hos bukspottkörtelkanalceller och strömmar till huvudkanalen i bukspottkörteln och sedan till den huvudsakliga gemensamma gallkanalen. På grund av dess närhet till bukspottkörteln kan den påverkas starkt av mikromiljöstörningar inducerade av tumörmassan (figur 1) och därför mer informativ än blod eller urin eller vävnadsbaserad profilering. Flera studier har undersökt potentialen hos bukspottkörteljuice för att identifiera nya biomarkörer för sjukdom med hjälp av olika tillvägagångssätt, inklusive cytologisk analys 13, proteomisk analys utförd med masspektrometri 14,15, bedömning av genetiska och epigenetiska markörer såsom K-ras och p53-mutationer 16,17^, förändringar i DNA-metylering¹⁸ och miRNA ¹⁹ . Tekniskt sett kan bukspottkörteljuice samlas intraoperativt eller med minimalt invasiva procedurer, såsom endoskopisk ultraljud, retrograd kolangio-pankreatografi eller genom endoskopisk insamling av duodenal juicesekretion²⁰. Det är ännu inte klart i vilken utsträckning bukspottskörteljuicekompositionen påverkas av den använda insamlingstekniken. Vi beskriver här det intraoperativa insamlingsförfarandet och visar att bukspottkörteljuice kan utgöra en värdefull källa för PDAC-biomarkörer.

Figur 1: Schematisk representation av pankreasjuice samling. (A) Schematisk representation som visar utsöndringen av bukspottkörteljuice i bukspottkörtelkanalen och dess samling under operationen. Insatsen visar en närbild av tumörmikromiljön: bukspottkörteljuice samlar molekyler som frigörs av tumör- och stromaceller i bukspottkörtelkanalerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Insamlingen av bukspottkörteljuice i genetiska och ortotopiska musmodeller av PDAC skulle uppskattas i perspektivet att utnyttja denna biofluid i prekliniska mekanistiska studier; Denna procedur kan dock vara tekniskt mycket utmanande och är inte genomförbar för enklare modeller som subkutana tumörer. Av denna anledning identifierade vi tumörinterstitiell vätska (TIF) som en alternativ källa till bukspottkörteljuice, för dess liknande egenskap att fungera som en indikator på omgivande störningar. Interstitiell vätska (IF) är den extracellulära vätskan, som finns utanför blod och lymfkärl, som badar vävnadsceller²¹. IF-kompositionen påverkas av både blodcirkulationen till organet och lokal utsöndring; i själva verket producerar och utsöndrar omgivande celler aktivt proteiner i IF²¹. Interstitium återspeglar mikromiljöförändringar i omgivande vävnader och kan därför utgöra en värdefull källa för biomarkörupptäckt i flera patologiska sammanhang, såsom tumörer. Den höga koncentrationen av lokalt utsöndrade proteiner i TIF kan användas för att identifiera kandidatmolekyler som ska testas som prognostiska eller diagnostiska biomarkörer i plasma^22,23,24. Flera studier har visat att TIF är ett lämpligt prov för proteomiska metoder med hög genomströmning, såsom masspektrometritekniker 23,24,25^, samt multiplex ELISA-tillvägagångssätt 26 och mikroRNA-profilering ²⁷.

Flera tillvägagångssätt har föreslagits för isolering av IF i tumörer, som i stort sett kan kategoriseras som de vivo (kapillär ultrafiltrering 28,29,30,31 och mikrodialys 32,33,34,35) och ex vivo-metoder (vävnadscentrifugering ^22,36,37,38 och vävnadseluering 39,40,41,42). Dessa tekniker har granskats i detalj^43,44. Vid valet av lämplig metod bör hänsyn tas till frågor som analyser och tillämpningar i senare led och den återvunna volymen. Vi använde nyligen detta tillvägagångssätt som ett principbevis för att visa den olika metaboliska aktiviteten hos tumörer från två murina pankreas adenokarcinomcellinjer¹². Baserat på litteratur ^24,38 valde vi att använda låghastighetscentrifugeringsmetoden för att undvika cellbrott och utspädning från intracellulärt innehåll. Både mängden glukos och laktat i TIF återspeglade de olika glykolytiska egenskaperna hos de två olika cellinjerna. Här beskriver vi i detalj protokollet för de två vanligaste metoderna för isolering av TIF: vävnadscentrifugering och vävnadseluering (figur 2).

Figur 2: Schematisk representation av tumörinterstitiella vätskeisoleringsmetoder. Schematisk illustration av de tekniker som beskrivs i detalj i protokollet, nämligen vävnadscentrifugering (A) och vävnadsel (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

För alla inskrivna patienter samlades perifert blod och bukspottkörteljuice vid operationen enligt protokoll som godkänts av institutionens etiska kommitté. Alla patienter inkluderades i studien efter undertecknat informerat samtycke inklusive insamling av biologiska prover och kliniska data. Studien godkändes av institutionens etiska kommitté (protokollnummer ICH-595, godkännande utfärdat i maj 2009). Förfaranden som involverade möss och deras vård överensstämde med EU:s och institutionernas riktlinjer (pro…

Representative Results

Vi följde proceduren som beskrivs ovan för att erhålla bukspottkörteljuice från patienter med PDAC (n = 31) och andra godartade bukspottkörtelbesvär (icke-PDAC, n = 9), inklusive pankreatit (n = 2), papillär-ampullatumörer (n = 4), neuroendokrina tumörer (n = 2), intraduktal papillär mucinös neoplasi (IPMN; n = 1) 12. Bukspottkörteljuiceproverna utsattes sedan för metabolomisk analys med kärnmagnetisk resonans (1H-NMR)12. Genom att fil…

Discussion

I denna studie har vi beskrivit tekniken för att intraoperativt samla bukspottkörteljuice, en i stort sett outforskad vätskebiopsi. Vi har nyligen visat att bukspottkörteljuice kan utnyttjas som en källa till metaboliska markörer för sjukdom¹². Metabolomisk analys på andra flytande biopsier, såsom blod ^5,6,7, urin⁸ och saliv^9, har visat lovande resu…

Materials

1 mL syringe	BD Biosciences	309659
1.5 mL Eppendorf tube	Greiner BioOne	GR616201
20 µm nylon cell strainer	pluriSelect	43-50020-03
25G needle	BD Biosciences	305122
3 mL K2EDTA vacutainer	BD Biosciences	366473
3 mL syringe	BD Biosciences	309656
50 mL Falcon tube	Corning	352098
Clamps	Medicon	06.20.12
Disposable scalpel	Medicom	9000-10
Fetal bovine serum	Microtech	MG10432
Flat-tipped forceps	Medicon	06.00.10
Penicillin-Streptomycin	Lonza	ECB3001D
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Protease inhibitor cocktail	Roche	34044100
RPMI medium	Euroclone	ECB9006L
Scissors	Medicon	02.04.09
Trypsin/EDTA 1x	Lonza	BE17-161F
Ultraglutamine 100x	Lonza	BE17-605E/U1