Isolement de liquides proximaux pour étudier le microenvironnement tumoral de l’adénocarcinome pancréatique

Summary

Le suc pancréatique est une source précieuse de biomarqueurs du cancer du pancréas humain. Nous décrivons ici une méthode de procédure de collecte peropératoire. Pour surmonter le défi de l’adoption de cette procédure dans des modèles murins, nous suggérons un échantillon alternatif, le liquide interstitiel tumoral, et décrivons ici deux protocoles pour son isolement.

Abstract

L’adénocarcinome pancréatique (PDAC) est la quatrième cause de décès lié au cancer, et deviendra bientôt la deuxième. Il existe un besoin urgent de variables associées à des pathologies pancréatiques spécifiques pour faciliter le diagnostic différentiel préopératoire et le profilage des patients. Le suc pancréatique est un fluide corporel relativement inexploré qui, en raison de sa proximité avec le site tumoral, reflète les changements dans les tissus environnants. Nous décrivons ici en détail la procédure de collecte peropératoire. Malheureusement, la traduction de la collecte de sucs pancréatiques en modèles murins de PDAC, pour effectuer des études mécanistes, est techniquement très difficile. Le liquide interstitiel tumoral (TIF) est le liquide extracellulaire, à l’extérieur du sang et du plasma, qui baigne les cellules tumorales et stromales. Tout comme le suc pancréatique, pour sa propriété de collecter et de concentrer les molécules qui se trouvent diluées dans le plasma, le TIF peut être exploité comme indicateur d’altérations microenvironnementales et comme source précieuse de biomarqueurs associés à la maladie. Le FIT n’étant pas facilement accessible, diverses techniques ont été proposées pour son isolement. Nous décrivons ici deux méthodes simples et techniquement peu exigeantes pour son isolement: la centrifugation tissulaire et l’élution tissulaire.

Introduction

L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est l’une des tumeurs les plus agressives et deviendra bientôt la deuxième cause de décès ^1,2,3. Il est bien connu pour son microenvironnement immunosuppresseur et pour son manque de réponse aux protocoles d’immunothérapie⁴. Actuellement, la résection chirurgicale est toujours la seule option curative pour PDAC, mais il existe une fréquence élevée de rechutes précoces et de complications postopératoires. L’absence de symptômes spécifiques jusqu’à un stade avancé ne permet pas un diagnostic précoce, contribuant ainsi aux délais de la maladie. En outre, le chevauchement des symptômes entre PDAC et d’autres pathologies pancréatiques bénignes peut entraver la réalisation d’un diagnostic rapide et fiable avec les stratégies de diagnostic actuelles. L’identification de variables associées à des pathologies pancréatiques spécifiques pourrait faciliter le processus de prise de décision chirurgicale et améliorer le profilage des patients.

Des résultats prometteurs dans la découverte de biomarqueurs ont été obtenus en utilisant des fluides corporels facilement accessibles, tels que le sang ^5,6,7, l’urine 8, la salive⁹ et le suc pancréatique ^10,11,12. De nombreuses études ont exploité des approches « omiques » globales, telles que des techniques génomiques, protéomiques et métabolomiques, pour identifier des molécules candidates ou des signatures qui pourraient faire la distinction entre l’ACPE et d’autres affections pancréatiques bénignes. Nous avons récemment démontré que le suc pancréatique, un fluide corporel relativement inexploré, peut être utilisé pour identifier les signatures métaboliques de patients ayant des profils cliniques distincts¹². Le suc pancréatique est un liquide riche en protéines, qui accumule le sécrétome des cellules canalaires pancréatiques et s’écoule vers le canal pancréatique principal, puis vers le canal cholédoque principal. En raison de sa proximité avec le pancréas, il pourrait être fortement affecté par les perturbations microenvironnementales induites par la masse tumorale (Figure 1), et donc plus informatif que le sang ou l’urine, ou le profilage tissulaire. Plusieurs études ont exploré le potentiel du suc pancréatique pour identifier de nouveaux biomarqueurs de la maladie en utilisant diverses approches, y compris l’analyse cytologique 13, l’analyse protéomique effectuée par spectrométrie de masse 14,15, l’évaluation de marqueurs génétiques et épigénétiques tels que les mutations K-ras et p53 16,17^, les altérations de la méthylation de l’ADN¹⁸ et les miARN ¹⁹ . Techniquement, le suc pancréatique peut être collecté en peropératoire ou avec des procédures mini-invasives, telles que l’échographie endoscopique, la cholangio-pancréatographie rétrograde ou par collecte endoscopique de la sécrétion de suc duodénal²⁰. On ne sait pas encore dans quelle mesure la composition du suc pancréatique est affectée par la technique de collecte utilisée. Nous décrivons ici la procédure de prélèvement peropératoire et montrons que le suc pancréatique peut représenter une source précieuse pour les biomarqueurs PDAC.

Figure 1 : Représentation schématique de la collection de sucs pancréatiques. (A) Représentation schématique représentant la sécrétion de suc pancréatique dans le canal pancréatique et sa collecte pendant la chirurgie. L’encart montre un gros plan du microenvironnement tumoral: le suc pancréatique recueille les molécules libérées par les cellules tumorales et stromales dans les canaux pancréatiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La collecte de suc pancréatique dans des modèles murins génétiques et orthotopiques de PDAC serait appréciée dans la perspective d’exploiter ce biofluide dans des études mécanistiques précliniques ; Cependant, cette procédure peut être techniquement très difficile et n’est pas réalisable pour des modèles plus simples tels que les tumeurs sous-cutanées. Pour cette raison, nous avons identifié le liquide interstitiel tumoral (TIF) comme une source alternative au suc pancréatique, pour sa caractéristique similaire d’agir comme un indicateur des perturbations environnantes. Le liquide interstitiel (SI) est le liquide extracellulaire, trouvé à l’extérieur des vaisseaux sanguins et lymphatiques, qui baigne les cellules tissulaires²¹. La composition de la FI est affectée à la fois par la circulation sanguine vers l’organe et par la sécrétion locale; en fait, les cellules environnantes produisent et sécrètent activement des protéines dans l’IF²¹. L’interstitium reflète les changements microenvironnementaux des tissus environnants et pourrait donc représenter une source précieuse pour la découverte de biomarqueurs dans plusieurs contextes pathologiques, tels que les tumeurs. La forte concentration de protéines sécrétées localement dans le TIF peut être utilisée pour identifier les molécules candidates à tester comme biomarqueurs pronostiques ou diagnostiques dans le plasma^22,23,24. Plusieurs études ont prouvé que le TIF est un échantillon approprié pour les approches protéomiques à haut débit, telles que les techniques de spectrométrie de masse 23,24,25^, ainsi que les approches ELISA multiplex 26 et le profilage des microARN ²⁷.

Plusieurs approches ont été proposées pour l’isolement de la FI dans les tumeurs, qui peuvent être largement classées comme de vivo (ultrafiltration capillaire 28,29,30,31 et microdialyse 32,33,34,35) et ex vivo (centrifugation tissulaire ^22,36,37,38 et élution tissulaire 39,40,41,42). Ces techniques ont été examinées en détail^43,44. Le choix de la méthode appropriée devrait tenir compte de questions telles que les analyses et les applications en aval et le volume récupéré. Nous avons récemment utilisé cette approche comme preuve de principe pour démontrer l’activité métabolique différente des tumeurs de deux lignées cellulaires d’adénocarcinome pancréatique murin¹². Sur la base de la littérature^24,38, nous avons choisi d’utiliser la méthode de centrifugation à basse vitesse pour éviter la rupture cellulaire et la dilution du contenu intracellulaire. La quantité de glucose et de lactate dans le TIF reflétait les différentes caractéristiques glycolytiques des deux lignées cellulaires différentes. Nous décrivons ici en détail le protocole des deux méthodes les plus couramment utilisées pour l’isolement du FIT : la centrifugation tissulaire et l’élution tissulaire (Figure 2).

Figure 2 : Représentation schématique des méthodes d’isolement du liquide interstitiel tumoral. Illustration schématique des techniques décrites en détail dans le protocole, à savoir la centrifugation tissulaire (A) et l’élution tissulaire (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Pour tous les patients recrutés, le sang périphérique et le suc pancréatique ont été prélevés au moment de la chirurgie selon les protocoles approuvés par le comité d’éthique de l’établissement. Tous les patients ont été recrutés dans l’étude après avoir signé un consentement éclairé, y compris la collecte d’échantillons biologiques et de données cliniques. L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’institution (protocole numéro ICH-595, approbation délivrée en mai 2…

Representative Results

Nous avons suivi la procédure décrite ci-dessus pour obtenir le suc pancréatique de patients atteints de PDAC (n = 31) et d’autres affections pancréatiques bénignes (non-PDAC, n = 9), y compris la pancréatite (n = 2), les tumeurs papillaires de l’ampoule (n = 4), les tumeurs neuroendocrines (n = 2), la néoplasie mucineuse papillaire intracanalaire (IPMN; n = 1) 12. Les échantillons de suc pancréatique ont ensuite été soumis à une analyse métabolomique par résonance magnétique nu…

Discussion

Dans cette étude, nous avons décrit la technique de collecte peropératoire du suc pancréatique, une biopsie liquidienne largement inexplorée. Nous avons récemment montré que le suc pancréatique peut être exploité comme source de marqueurs métaboliques de la maladie¹². L’analyse métabolomique sur d’autres biopsies liquides, telles que le sang ^5,6,7, l’urine⁸ et la salive⁹<sup…

Materials

1 mL syringe	BD Biosciences	309659
1.5 mL Eppendorf tube	Greiner BioOne	GR616201
20 µm nylon cell strainer	pluriSelect	43-50020-03
25G needle	BD Biosciences	305122
3 mL K2EDTA vacutainer	BD Biosciences	366473
3 mL syringe	BD Biosciences	309656
50 mL Falcon tube	Corning	352098
Clamps	Medicon	06.20.12
Disposable scalpel	Medicom	9000-10
Fetal bovine serum	Microtech	MG10432
Flat-tipped forceps	Medicon	06.00.10
Penicillin-Streptomycin	Lonza	ECB3001D
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Protease inhibitor cocktail	Roche	34044100
RPMI medium	Euroclone	ECB9006L
Scissors	Medicon	02.04.09
Trypsin/EDTA 1x	Lonza	BE17-161F
Ultraglutamine 100x	Lonza	BE17-605E/U1