Isolering af proksimale væsker for at undersøge tumormikromiljøet af pancreas adenocarcinom

Summary

Bugspytkirtelsaft er en dyrebar kilde til biomarkører for kræft i bugspytkirtlen. Vi beskriver her en metode til intraoperativ indsamlingsprocedure. For at overvinde udfordringen med at vedtage denne procedure i murinemodeller foreslår vi en alternativ prøve, tumor interstitiel væske, og beskriver her to protokoller for dens isolering.

Abstract

Pancreas adenocarcinom (PDAC) er den fjerde førende årsag til kræftrelateret død og snart at blive den anden. Der er et presserende behov for variabler forbundet med specifikke bugspytkirtelpatologier for at hjælpe præoperativ differentialdiagnose og patientprofilering. Pancreasjuice er en relativt uudforsket kropsvæske, som på grund af sin nærhed til tumorstedet afspejler ændringer i det omgivende væv. Her beskriver vi detaljeret den intraoperative indsamlingsprocedure. Desværre er oversættelse af bugspytkirtelsaftsamling til murinemodeller af PDAC til udførelse af mekanistiske undersøgelser teknisk meget udfordrende. Tumor interstitiel væske (TIF) er den ekstracellulære væske uden for blod og plasma, som bader tumor- og stromalceller. På samme måde som bugspytkirtelsaft, for dets egenskab til at indsamle og koncentrere molekyler, der findes fortyndet i plasma, kan TIF udnyttes som en indikator for mikromiljømæssige ændringer og som en værdifuld kilde til sygdomsassocierede biomarkører. Da TIF ikke er let tilgængelig, er der foreslået forskellige teknikker til isolering. Vi beskriver her to enkle og teknisk krævende metoder til isolering: vævscentrifugering og vævseluering.

Introduction

Pankreatisk duktalt adenocarcinom (PDAC) er en af de mest aggressive tumorer og snart at blive den næststørste dødsårsag ^1,2,3. Det er kendt for sit immunsuppressive mikromiljø og for dets manglende reaktion på immunterapiprotokoller⁴. I øjeblikket er kirurgisk resektion stadig den eneste helbredende mulighed for PDAC, men alligevel er der en høj frekvens af tidlige tilbagefald og postkirurgiske komplikationer. Manglen på specifikke symptomer indtil et avanceret stadium tillader ikke en tidlig diagnose, hvilket bidrager til sygdommens deadlines. Desuden kan overlapningen af symptomer mellem PDAC og andre godartede bugspytkirtelpatologier hæmme opnåelsen af en hurtig og pålidelig diagnose med de nuværende diagnostiske strategier. Identifikation af variabler forbundet med specifikke bugspytkirtelpatologier kan lette den kirurgiske beslutningsproces og forbedre patientprofilering.

Lovende resultater i biomarkøropdagelse er opnået ved hjælp af let tilgængelige kropsvæsker, såsom blod ^5,6,7, urin⁸, spyt 9 og bugspytkirtelsaft^10,11,12. Mange undersøgelser har udnyttet omfattende “omics” tilgange, såsom genomiske, proteomiske og metabolomiske teknikker, til at identificere kandidatmolekyler eller signaturer, der kan diskriminere mellem PDAC og andre godartede pancreas lidelser. Vi har for nylig demonstreret, at bugspytkirtelsaft, en relativt uudforsket kropsvæske, kan bruges til at identificere metaboliske signaturer hos patienter med forskellige kliniske profiler¹². Bugspytkirtelsaft er en proteinrig væske, som akkumulerer sekretomet af bugspytkirtelkanalerne og strømmer til hovedbugspytkirtelkanalen og derefter til den vigtigste fælles galdekanal. På grund af dets nærhed til bugspytkirtlen kan det blive stærkt påvirket af mikromiljøforstyrrelser induceret af tumormassen (figur 1) og derfor mere informativ end blod eller urin eller vævsbaseret profilering. Flere undersøgelser har undersøgt potentialet i bugspytkirtelsaft til at identificere nye biomarkører for sygdom ved hjælp af forskellige tilgange, herunder cytologisk analyse¹³, proteomisk analyse udført ved massespektrometri 14,15, vurdering af genetiske og epigenetiske markører såsom K-ras og p53 mutationer 16,17^, ændringer i DNA-methylering 18 og miRNA’er ¹⁹ . Teknisk set kan bugspytkirtelsaft indsamles intraoperativt eller med minimalt invasive procedurer, såsom endoskopisk ultralyd, retrograd cholangio-pancreatografi eller ved endoskopisk samling af duodenal juice sekretion²⁰. Det er endnu ikke klart, i hvilket omfang pancreasjuicesammensætningen påvirkes af den anvendte indsamlingsteknik. Vi beskriver her den intraoperative indsamlingsprocedure og viser, at bugspytkirtelsaft kan repræsentere en dyrebar kilde til PDAC-biomarkører.

Figur 1: Skematisk repræsentation af pancreas juice samling. (A) Skematisk repræsentation, der viser udskillelsen af bugspytkirtelsaft i bugspytkirtelkanalen og dens samling under operationen. Indsatsen viser et nærbillede af tumormikromiljøet: bugspytkirtelsaft samler molekyler frigivet af tumor- og stromale celler i bugspytkirtelkanalerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Indsamlingen af bugspytkirtelsaft i genetiske og ortopiske musemodeller af PDAC ville blive værdsat i perspektivet for at udnytte denne biofluid i prækliniske mekanistiske undersøgelser; Denne procedure kan dog være teknisk meget udfordrende og er ikke mulig for enklere modeller såsom subkutane tumorer. Af denne grund identificerede vi tumor interstitiel væske (TIF) som en alternativ kilde til bugspytkirtelsaft for dets lignende egenskab ved at fungere som en indikator for omgivende forstyrrelser. Interstitiel væske (IF) er den ekstracellulære væske, der findes uden for blod og lymfekar, som bader vævsceller²¹. IF-sammensætningen påvirkes af både blodcirkulationen til organet og lokal sekretion; faktisk producerer og udskiller omgivende celler aktivt proteiner i IF²¹. Interstitium afspejler mikromiljømæssige ændringer i omgivende væv og kan derfor udgøre en værdifuld kilde til biomarkøropdagelse i flere patologiske sammenhænge, såsom tumorer. Den høje koncentration af lokalt udskilte proteiner i TIF kan bruges til at identificere kandidatmolekyler, der skal testes som prognostiske eller diagnostiske biomarkører i plasma^22,23,24. Flere undersøgelser har vist, at TIF er en passende prøve til proteomiske tilgange med høj kapacitet, såsom massespektrometriteknikker 23,24,25 samt multiplex ELISA-tilgange 26 og mikroRNA-profilering ²⁷.

Der er foreslået flere metoder til isolering af IF i tumorer, som bredt kan kategoriseres som in vivo (kapillær ultrafiltrering 28,29,30,31 og mikrodialyse 32,33,34,35) og ex vivo-metoder (vævscentrifugering ^22,36,37,38 og vævseluation 39,40,41,42). Disse teknikker er blevet gennemgået i omfattende detaljer^43,44. Ved valget af den passende metode bør der tages hensyn til spørgsmål som f.eks. downstreamanalyser og applikationer og den genvundne mængde. Vi brugte for nylig denne tilgang som et bevis på princippet for at demonstrere den forskellige metaboliske aktivitet af tumorer fra to murine pancreas adenocarcinom cellelinjer¹². Baseret på litteratur ^24,38 valgte vi at bruge lavhastighedscentrifugeringsmetoden for at undgå cellebrud og fortynding fra intracellulært indhold. Både mængden af glukose og laktat i TIF afspejlede de forskellige glykolytiske egenskaber ved de to forskellige cellelinjer. Her beskriver vi detaljeret protokollen for de to mest almindeligt anvendte metoder til isolering af TIF: vævscentrifugering og vævseluering (figur 2).

Figur 2: Skematisk repræsentation af tumor interstitielle væskeisoleringsmetoder. Skematisk illustration af de teknikker, der er beskrevet detaljeret i protokollen, nemlig vævscentrifugering (A) og vævseluering (B). Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

For alle indskrevne patienter blev perifert blod og bugspytkirtelsaft indsamlet på tidspunktet for operationen i henhold til protokoller godkendt af institutionens etiske udvalg. Alle patienterne blev inkluderet i studiet efter underskrevet informeret samtykke, herunder indsamling af biologiske prøver og kliniske data. Undersøgelsen blev godkendt af institutionens etiske udvalg (protokolnummer ICH-595, godkendelse udstedt i maj 2009). Procedurer, der involverede mus og deres pleje, var i overensstemmelse med EU’s og i…

Representative Results

Vi fulgte den ovenfor beskrevne procedure for at opnå bugspytkirtelsaft fra patienter med PDAC (n = 31) og andre godartede bugspytkirtelpåvirkninger (ikke-PDAC, n = 9), herunder pancreatitis (n = 2), papillær-ampulla tumorer (n = 4), neuroendokrine tumorer (n = 2), intraduktal papillær mucinøs neoplasi (IPMN; n = 1)12. Prøverne af bugspytkirtelsaft blev derefter underkastet metabolomisk analyse ved anvendelse af kernemagnetisk resonans (1H-NMR)12</su…

Discussion

I denne undersøgelse har vi beskrevet teknikken til intraoperativt at indsamle bugspytkirtelsaft, en stort set uudforsket væskebiopsi. Vi har for nylig vist, at bugspytkirtelsaft kan udnyttes som en kilde til metaboliske markører for sygdom¹². Metabolomisk analyse af andre flydende biopsier, såsom blod ^5,6,7, urin⁸ og spyt^9, har vist lovende resultater i…

Materials

1 mL syringe	BD Biosciences	309659
1.5 mL Eppendorf tube	Greiner BioOne	GR616201
20 µm nylon cell strainer	pluriSelect	43-50020-03
25G needle	BD Biosciences	305122
3 mL K2EDTA vacutainer	BD Biosciences	366473
3 mL syringe	BD Biosciences	309656
50 mL Falcon tube	Corning	352098
Clamps	Medicon	06.20.12
Disposable scalpel	Medicom	9000-10
Fetal bovine serum	Microtech	MG10432
Flat-tipped forceps	Medicon	06.00.10
Penicillin-Streptomycin	Lonza	ECB3001D
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Protease inhibitor cocktail	Roche	34044100
RPMI medium	Euroclone	ECB9006L
Scissors	Medicon	02.04.09
Trypsin/EDTA 1x	Lonza	BE17-161F
Ultraglutamine 100x	Lonza	BE17-605E/U1