Eine nicht-kodierende kleine RNA MicC trägt zur Virulenz von Proteinen der äußeren Membran in Salmonella enteritidis bei
Summary
Ein λ-Red-vermitteltes Rekombinationssystem wurde verwendet, um eine Deletionsmutante einer kleinen nicht-kodierenden RNA micC zu erzeugen.
Abstract
Eine nicht-kodierende kleine RNA (sRNA) ist ein neuer Faktor zur Regulierung der Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene. Eine Art sRNA MicC, wie sie in Escherichia coli und Salmonella Typhimurium bekannt ist, könnte die Expression von Proteinen der äußeren Membran unterdrücken. Um die Regulationsfunktion von micC in Salmonella Enteritidis weiter zu untersuchen, klonierten wir das micC-Gen im Salmonella Enteritidis-Stamm 50336 und konstruierten dann die Mutante 50336Δ micC durch das λ Red-basierte Rekombinationssystem und die komplementäre Mutante 50336Δ micC/p micC, die das rekombinante Plasmid pBR322 trägt, das micC exprimiert. Die Ergebnisse der qRT-PCR zeigten, dass die Transkription von ompD in 50336Δ micC 1,3-fach höher war als die im Wildtyp-Stamm, während die Transkription von ompA und ompC in 50336ΔmicC 2,2-fach und 3-fach höher war als im Wildtyp-Stamm. Diese deuteten darauf hin, dass micC die Expression von ompA und ompC unterdrückt. In der folgenden Studie wurde die Pathogenität von 50336ΔmicC sowohl durch die Infektion von 6 Wochen alten Balb/c-Mäusen als auch durch 1 Tag alte Hühner nachgewiesen. Das Ergebnis zeigte, dass die LD 50 des Wildtyp-Stammes 50336, die Mutanten 50336Δ micC und 50336Δ micC/pmicC für 6 Wochen alte Balb/c-Mäuse 12,59 KBE, 5,01 KBE bzw. 19,95 KBE betrugen. Die LD 50 der Stämme für 1 Tag alte Hühner betrugen 1,13 x 109 KBE, 1,55 x 10 8 KBE bzw.2,54 x 10 8 KBE. Es zeigte sich, dass die Deletion von micC die Virulenz von S erhöht. Enteritidis bei Mäusen und Hühnern durch Regulierung der Expression von Proteinen der äußeren Membran.
Introduction
Nicht-kodierende kleine RNAs (sRNAs) sind 40-400 Nukleotide lang, die im Allgemeinen keine Proteine kodieren, aber unabhängig voneinander in bakteriellen Chromosomen transkribiert werden können 1,2,3. Die meisten sRNAs kodieren in den intergenen Regionen (IGRs) zwischen genkodierenden Regionen und interagieren mit Ziel-mRNAs durch Basenpaarungsaktionen und regulieren die Expression von Zielgenen auf posttranskriptioneller Ebene 4,5. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation des Stoffstoffwechsels, der Proteinsynthese der äußeren Membran, der Quorum-Sensing und der Virulenz-Genexpression5.
MicC ist ein kleines RNA-Transkript mit 109 Nukleotiden, das in Escherichia coli und Salmonella enterica serovar Typhimurium vorkommt und die Expression mehrerer Proteine der äußeren Membran wie OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 und Omp36 regulieren könnte 6,7,8,9. MicC reguliert die Expression von OmpC, indem es die Bindung des Ribosoms an den ompC-mRNA-Leader in vitro hemmt, und benötigt das Hfq-RNA-Chaperon für seine Funktion in Escherichia coli6. In Salmonella Typhimurium schaltet MicC ompD-mRNA über einen ≤12-bp-RNA-Duplex innerhalb der kodierenden Sequenz (Codons 23-26) aus und destabilisiert dann die endonukleolytische mRNA7. Dieser Regulationsprozess wird durch das Chaperonprotein Hfq10 unterstützt. Das OmpC ist ein reichlich vorhandenes äußeres Membranprotein, von dem angenommen wurde, dass es in Umgebungen mit hohen Nährstoff- und Toxinkonzentrationen, wie z. B. im Darm, wichtig ist6. Das OmpD-Porin ist das am häufigsten vorkommende äußere Membranprotein in Salmonella Typhimurium und macht etwa 1% des gesamten Zellproteins11 aus. OmpD ist an der Adhärenz an menschlichen Makrophagen und Darmepithelzellen beteiligt12. MicC unterdrückt auch die Expression von OmpC- und OmpD-Porinen. Es wird vermutet, dass MicC die Virulenz regulieren kann. Um neue Zielgene zu erforschen, die durch MicC reguliert werden, und um die Virulenzregulationsfunktion von micC zu untersuchen, klonierten wir das micC-Gen im Salmonella Enteritidis (SE)-Stamm 50336 und konstruierten dann die Mutante 50336ΔmicC und die komplementäre Mutante 50336ΔmicC/p micC. Neuartige Zielgene wurden mittels qRT-PCR gescreent. Die Virulenz von 50336ΔmicC wurde durch Mäuse- und Hühnerinfektionen nachgewiesen.
Protocol
Representative Results
Discussion
S. Enteritidis ist ein wichtiger fakultativer intrazellulärer Erreger, der junge Hühner infizieren kann und Symptome von Enteritis bis hin zu systemischer Infektion und Tod hervorruft17,18. Darüber hinaus verursacht S. Enteritidis latente Infektionen bei erwachsenen Hühnern, und chronische Träger kontaminieren Geflügelprodukte, was beim Menschen zu lebensmittelbedingten Infektionen führt19. Der pathogene Mechanismu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Chinese National Science Foundation (Nr. 31972651 und 31101826), der Jiangsu High Education Science Foundation (Nr. 14KJB230002), des State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (Nr. SKLVBF201509) und des Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (Nr. YZ2014019) unterstützt, einem Projekt, das durch die Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) finanziert wird.
Materials
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
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