Un piccolo RNA non codificante MicC contribuisce alla virulenza nelle proteine della membrana esterna in Salmonella enteritidis
Summary
Un sistema di ricombinazione λ-rosso-mediato è stato utilizzato per creare un mutante di delezione di un piccolo microfono di RNA non codificante.
Abstract
Un piccolo RNA non codificante (sRNA) è un nuovo fattore per regolare l’espressione genica a livello post-trascrizionale. Una sorta di sRNA MicC, noto in Escherichia coli e Salmonella Typhimurium, potrebbe reprimere l’espressione delle proteine della membrana esterna. Per studiare ulteriormente la funzione di regolazione della micC in Salmonella Enteritidis, abbiamo clonato il gene micC nel ceppo 50336 di Salmonella Enteritidis, e poi abbiamo costruito il mutante 50336Δ micC con il sistema di ricombinazione λ Red based e il mutante 50336Δ micC/p micC completato che trasporta il plasmide ricombinante pBR322 che esprime micC. I risultati della qRT-PCR hanno dimostrato che la trascrizione di ompD nel micC 50336Δ era 1,3 volte superiore a quella del ceppo wild type, mentre la trascrizione di ompA e ompC nel micC 50336Δ era 2,2 volte superiore e 3 volte superiore a quella del ceppo wild type. Questi indicano che micC reprime l’espressione di ompA e ompC. Nel seguente studio, la patogenicità di 50336ΔmicC è stata rilevata sia infettando topi Balb / c di 6 settimane che polli di 1 giorno. Il risultato ha mostrato che la LD50 del ceppo wild type 50336, i mutanti 50336Δ micC e 50336Δ micC/pmicC per topi Balb/c di 6 settimane erano rispettivamente 12,59 CFU, 5,01 CFU e 19,95 CFU. I ceppi LD 50 per polli di 1 giorno erano rispettivamente 1,13 x 109 CFU, 1,55 x 10 8 CFU e2,54 x 10 8 CFU. Ha indicato che la delezione del micC ha aumentato la virulenza di S. Enteritidis nei topi e nei polli regolando l’espressione delle proteine della membrana esterna.
Introduction
I piccoli RNA non codificanti (sRNA) sono lunghi 40-400 nucleotidi, che generalmente non codificano proteine ma potrebbero essere trascritti indipendentemente nei cromosomi batterici 1,2,3. La maggior parte degli sRNA sono codificati nelle regioni intergeniche (IGR) tra regioni codificanti geni e interagiscono con gli mRNA bersaglio attraverso azioni di accoppiamento di basi e regolano l’espressione dei geni bersaglio a livello post-trascrizionale 4,5. Svolgono importanti ruoli di regolazione nel metabolismo delle sostanze, nella sintesi proteica della membrana esterna, nel quorum sensing e nell’espressione genica di virulenza5.
MicC è un trascritto di 109 nucleotidi di piccolo RNA presente in Escherichia coli e Salmonella enterica sierotipo Typhimurium, che potrebbe regolare l’espressione di più proteine della membrana esterna come OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 e Omp36 6,7,8,9. MicC regola l’espressione di OmpC inibendo il legame del ribosoma al leader dell’mRNA ompC in vitro e richiede lo chaperone dell’Hfq RNA per la sua funzione in Escherichia coli6. In Salmonella Typhimurium, MicC silenzia l’mRNA ompD attraverso un duplex di RNA ≤12-bp all’interno della sequenza codificante (codoni 23-26) e quindi destabilizza l’mRNA endonucleolitico7. Questo processo di regolazione è assistito dalla proteina chaperone Hfq10. L’OmpC è un’abbondante proteina della membrana esterna che si pensava fosse importante in ambienti in cui le concentrazioni di nutrienti e tossine erano elevate, come nell’intestino6. La porina OmpD è la proteina della membrana esterna più abbondante in Salmonella Typhimurium e rappresenta circa l’1% della proteina cellulare totale11. OmpD è coinvolto nell’aderenza ai macrofagi umani e alle cellule epiteliali intestinali12. MicC reprime anche l’espressione delle porine OmpC e OmpD. Si pensa che MicC possa regolare la virulenza. Per esplorare nuovi geni bersaglio regolati da MicC e studiare la funzione di regolazione della virulenza di micC, abbiamo clonato il gene micC nel ceppo 50336 di Salmonella Enteritidis (SE), quindi abbiamo costruito il mutante 50336ΔmicC e il mutante complementare 50336ΔmicC/p micC. Nuovi geni bersaglio sono stati sottoposti a screening mediante qRT-PCR. La virulenza di 50336ΔmicC è stata rilevata da infezioni da topi e polli.
Protocol
Representative Results
Discussion
S. Enteritidis è un importante patogeno intracellulare facoltativo che può infettare i giovani polli e produce sintomi da enterite a infezione sistemica e morte17,18. Inoltre, S. Enteritidis provoca infezioni latenti nei polli adulti e i portatori cronici contaminano i prodotti avicoli, causando infezioni di origine alimentare nell’uomo19. Il meccanismo patogenetico di S. Enteritidis rimane da sondare ulteriormente….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Chinese National Science Foundation (Nos. 31972651 e 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), un progetto finanziato dal Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
Materials
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
References
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