인간 iPSC 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포를 사용하여 3D 심장 미세 조직 배열의 제조
Summary
여기서, 우리는 미리 분화된 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포로 구성된 3D 자가 조립 심장 미세 조직 배열을 생성하는 사용하기 쉬운 방법론을 기술합니다. 심장 미세 조직을 생성하는 기술을 요구하는 이 사용자 친화적이고 낮은 세포는 질병 모델링 및 약물 개발의 초기 단계를 위해 구현될 수 있습니다.
Abstract
유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)에서 인간 심근세포(CM), 심장 섬유아세포(CFs), 내피세포(EC)의 생성은 조직 발달과 질병을 이끄는 다른 심혈관 세포 모형 사이에서 복잡한 상호작용을 연구할 수 있는 특별한 기회를 제공하고 있다. 심장 조직 모델의 영역에서, 몇몇 정교한 3차원 (3D) 접근은 세포 외 매트릭스와 크로스 링커의 조합으로 생리적 관련성 및 토착 조직 환경을 모방하기 위하여 유도된 다능성 줄기 세포 유래 심근세포 (iPSC-CM)를 이용합니다. 그러나 이러한 시스템은 미세 제조 전문 지식없이 조작하기가 복잡하고 자체 조립하는 데 몇 주가 필요합니다. 가장 중요한 것은, 이 시스템의 많은 것은 인간적인 심혼에 있는 비 myocytes의 60% 이상을 구성하는 혈관 세포 및 심장 섬유아세포부족입니다. 여기에서 우리는 심장 미세 조직을 제조하는 iPSCs에서 모든 3개의 심장 세포 모형의 파생을 기술합니다. 이 촉진 복제 성형 기술은 몇 주 동안 표준 다중 잘 세포 배양 판에서 심장 미세 조직 배양을 허용합니다. 이 플랫폼은 초기 시드 밀도에 따라 미세 조직 크기를 사용자가 정의한 제어를 허용하며 관찰 가능한 심장 미세 조직 수축을 달성하기 위해 자체 조립에 3 일 미만이 필요합니다. 더욱이, 심장 마이크로티슈는 유동 세포측정및 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)을 사용하여 단세포 심문을 위한 높은 세포 생존가능성을 유지하면서 쉽게 소화될 수 있다. 우리는 심장 미세 조직의 이 체외 모형이 약 발견 및 질병 모델링에 있는 검증 연구를 가속화하는 것을 도울 것이라는 점을 구상합니다.
Introduction
심혈관 연구 분야의 약물 발견 및 질병 모델링은 임상적으로 관련된 샘플과 부적절한 번역 도구의 부족으로 인해 몇 가지 도전에 직면하고 있습니다. 매우 복잡한 전임상 모델 또는 체외 외 단일 세포 모델의 지나치게 단순화된 결과 재현 가능한 방식으로 병리학적 조건을 나타내지 않습니다. 따라서, 여러 소형 조직 설계 플랫폼은 높은 처리량 방식으로 적용의 용이성과 조직 기능의 충실한 회수 사이의 균형을 달성하는 것을 목표로, 격차를 해소하는 데 도움이 진화했다2,3. 유도 된 다능성 줄기 세포 (iPSC) 기술의 출현으로, 조직 엔지니어링 도구는 연구 질문에 대답하기 위해 기본 심혈관 질환 상태 또는 없이 환자 특정 세포에 적용 할 수 있습니다4,5,6. 심장 조직과 유사한 세포 구성을 가진 이러한 조직 설계 모델은 하나 또는 다중 세포 유형의 행동에 병리학적 변화에 의해 유도 된 심장 독성 및 기능 장애를 테스트하는 약물 개발 노력에 활용 될 수있다.
인간 iPSC에서 파생된 자가 조립 된 마이크로 조직 또는 오르가노이드는 생체 내 와 기능적 유사성을 나타내는 소형 조직과 유사한 어셈블리인 3차원 (3D) 구조입니다. iPSC의 지시된 분화를 통해 또는 배아 바디4의 대형을 통해 그(것)들에게 오르가노이드의 형성을 허용하는 몇몇 다른 접근이 있습니다. 결과 오르가노이드는 유기 발생을 유발하는 형태 유전학 적 과정을 연구하는 데 필수적인 도구입니다. 그러나, 다양한 세포 집단의 존재와 자기 조직에 있는 다름은 다른 organoids5 사이 결과에 있는 가변성으로 이끌어 낼 수 있습니다. 대안적으로, 국소 세포 상호 작용을 연구하기 위해 조직 별 세포 유형을 가진 마이크로 조직으로 자체 조립되는 미리 분화된 세포는 자가 조립 된 성분을 분리하는 것이 가능한 우수한 모델입니다. 특히 인간의 심장 연구에서다세포 성분을 가진 3D 심장 미세 조직의 개발은 세포가 다른 환자 라인 또는 상업적 근원에서 파생될 때 도전적인 것으로 입증되었습니다.
생리적으로 관련성이 있는, 개인화된, 체외 모델에서 세포 행동에 대한 기계적 이해를 향상시키기 위해, 이상적으로 모든 성분 세포 유형은 동일한 환자 라인에서 파생되어야 합니다. 인간의 심장의 맥락에서, 진정으로 대표적인 체외 모델은 주요 세포 유형, 즉 심근세포 (CM), 내피 세포 (EC), 및 심장 섬유 아세포 (CFs)6,7 사이에서 크로스토크를 캡처할 것입니다. 심근의 충실한 회수는 생물물리학 적 스트레칭 및 전기 생리 자극뿐만 아니라 EC 및 CFs8과 같은 세포 유형을 지원에서 발생하는 세포 세포 신호가 필요합니다. CF는 세포 외 매트릭스의 합성및 조직 구조를 유지하는 데 관여합니다. 그리고 병리학적인 상태에서, CF는 CMs9에 있는 섬유증을 유도하고 전기 전도를 바꿀 수 있습니다. 마찬가지로, EC는 파라크리인 신호 및 중요한 신진 대사 요구를 공급하여 CM의 수축 특성을 조절할 수 있습니다10. 따라서 생리학적으로 관련된 고처리량 실험을 수행할 수 있도록 3가지 주요 세포 유형으로 구성된 인간 심장 미세 조직에 대한 필요성이 있습니다.
여기에서는 인간 iPSC 유래 심근세포(iPSC-CM), iPSC 유래 내피 세포(iPSC-EC), iPSC 유래 심장 섬유아세포(iPSC-CFs) 및 심장 조직 균등에서의 3D 배양에 의한 심장 미세 조직의 제조에 대한 상향식 접근법을 설명합니다. 자발적으로 심장 미세 조직을 생성하는이 촉진 방법은 질병 모델링 및 심장 생리학의 기능적 및 기계론적 이해를위한 약물의 신속한 테스트에 활용 될 수있다. 더욱이, 그 같은 다세포 심장 미세 조직 플랫폼은 만성 또는 급성 배양 조건하에서 시간이 지남에 따라 심장 질병 진행을 모방하기 위하여 게놈 편집 기술로 이용될 수 있었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미리 분화된 iPSC-CM, iPSC-EC 및 iPSC-CF로부터 심장 마이크로티슈를 생성하기 위해서는 심장 마이크로티슈 내에서 접촉 억제된 세포 다짐 후 세포 수를 더 잘 제어하기 위한 고결한 배양을 확보하는 것이 필수적이다. 최근에는 지아코멜리 외. al.18 은 iPSC-CM, iPSC-EC 및 iPSC-CFs를 사용하여 심장 미세 조직의 제조를 입증했습니다. 설명된 방법을 사용하여 생성된 심장 미세 조직은 ~5,000세?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고에 대한 그녀의 유용한 피드백에 대한 박사 아만다 체이스 감사합니다. 자금 지원은 캘리포니아 대학, T29FT0380 (D.T.) 및 27IR-0012 (J.C.W.의 담배 관련 질병 연구 프로그램 (TRDRP)에 의해 제공되었습니다; 미국 심장 협회 20POST35210896 (H.K.) 및 17MERIT33610009 (J.C.W.); 및 국립 보건원 (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851, NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
Materials
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
References
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