ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製
Summary
ここでは、分化前のヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、および内皮細胞からなる3D自己組織化心臓ミクロ組織アレイを生成するための使いやすい方法論について説明する。心臓ミクロ組織を生成するためにこのユーザーフレンドリーで低細胞を必要とする技術は、疾患モデリングおよび医薬品開発の初期段階に実装することができる。
Abstract
人工多能性幹細胞(iPSC)からのヒト心筋細胞(CM)、心臓線維芽細胞(CF)、および内皮細胞(EC)の生成は、組織発達および疾患を駆動する異なる心血管細胞型間の複雑な相互作用を研究するユニークな機会を提供してきた。心臓組織モデルの分野では、いくつかの洗練された三次元(3D)アプローチが、誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(iPSC-CM)を使用して、細胞外マトリックスと架橋剤の組み合わせで生理学的関連性と天然組織環境を模倣します。しかし、これらのシステムは、微細加工の専門知識なしで製造するのが複雑であり、自己組み立てに数週間かかります。最も重要なのは、これらのシステムの多くは、ヒト心臓の非筋細胞の60%以上を占める血管細胞および心臓線維芽細胞を欠いている。ここでは、心臓ミクロ組織を作製するためのiPSCsからの3つの心臓細胞型すべての導出について説明する。この容易なレプリカ成形技術により、標準的なマルチウェル細胞培養プレートで数週間心臓微小組織培養が可能になります。このプラットフォームは、初期播種密度に基づいてマイクロ組織サイズをユーザー定義で制御でき、観察可能な心臓マイクロ組織収縮を達成するために自己組織化に3日未満かかります。さらに、心臓ミクロ組織は、フローサイトメトリーおよび単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)の使用により、単一細胞尋問のための高い細胞生存率を維持しながら容易に消化することができる。心臓ミクロ組織のこの in vitro モデルは、創薬および疾患モデリングにおける検証研究の加速に役立つと想定しています。
Introduction
心臓血管研究の分野における創薬と疾患モデリングは、臨床的に関連するサンプルの不足と不十分なトランスレーショナルツール1のために、いくつかの課題に直面しています。高度に複雑な前臨床モデルまたは過度に単純化されたインビトロ単一細胞モデルは、再現可能な方法で病態生理学的状態を示さない。したがって、いくつかの小型化された組織工学プラットフォームは、ハイスループットな方法での適用の容易さと組織機能の忠実な反復との間のバランスを達成することを目標に、ギャップを埋めるのを助けるために進化してきました2,3。人工多能性幹細胞(iPSC)技術の出現により、組織工学ツールを心血管疾患状態の有無にかかわらず患者固有の細胞に適用して、研究上の質問に答えることができます4,5,6。心臓組織に類似した細胞組成を有するこのような組織操作モデルは、1つまたは複数の細胞型の挙動における病理学的変化によって誘発される心毒性および機能障害について試験するための医薬品開発努力において利用され得る。
ヒトiPSCに由来する自己組織化ミクロ組織またはオルガノイドは、 インビボ対応 物と機能的類似性を示す小型組織様集合体である三次元(3D)構造である。iPS細胞の指向性分化または胚様体の形成を介して その場で オルガノイドを形成できるいくつかの異なるアプローチがある4。得られたオルガノイドは、有機生成を駆動する形態形成過程を研究するために不可欠なツールである。しかし、さまざまな細胞集団の存在と自己組織化の違いは、異なるオルガノイド間の転帰のばらつきにつながる可能性があります5。あるいは、局所的な細胞間相互作用を研究するために組織特異的細胞型を有するミクロ組織に自己組織化される前分化細胞は、優れたモデルであり、自己組織化成分を単離することが実行可能である。特にヒト心臓研究において、細胞が異なる患者系統または市販の供給源に由来する場合、多細胞成分を有する3D心臓微小組織の開発は困難であることが証明されている。
生理学的に関連性のある個別化されたin vitroモデルにおける細胞挙動の機構的理解を改善するためには、理想的には、すべての構成細胞型が同じ患者系統に由来するべきである。ヒトの心臓の文脈では、真に代表的な心臓in vitroモデルは、優勢な細胞型、すなわち心筋細胞(CM)、内皮細胞(EC)、および心臓線維芽細胞(CF)間のクロストークを捉えるだろう6,7。心筋の忠実な反復には、生物物理学的伸張と電気生理学的刺激だけでなく、ECやCFなどの細胞型をサポートすることから生じる細胞間シグナル伝達も必要です8。CFは、細胞外マトリックスの合成および組織構造の維持に関与している。病理学的状態では、CFは線維症を誘発し、CMs9の電気伝導を変化させることができる。同様に、ECはパラクリンシグナル伝達と重要な代謝要求の供給を通じてCMの収縮特性を調節することができます10。したがって、生理学的に関連するハイスループット実験を実施できるように、3つの主要な細胞型すべてで構成されるヒト心臓ミクロ組織が必要である。
ここでは、ヒトiPSC由来心筋細胞(iPSC-CM)、iPSC由来内皮細胞(iPSC-EC)、iPSC由来心臓線維芽細胞(iPSC-CF)の誘導による心臓微細組織の作製におけるボトムアップアプローチと、均一な心臓微小組織アレイにおけるそれらの3D培養について述べる。自発的に鼓動する心臓ミクロ組織を生成するこの容易な方法は、心臓生理機能の機能的および機構的理解のための疾患モデリングおよび薬物の迅速な試験に利用することができる。さらに、このような多細胞心臓マイクロ組織プラットフォームは、慢性または急性の培養条件下で経時的に心臓病の進行をエミュレートするために、ゲノム編集技術によって利用され得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
分化前のiPSC-CM、iPSC-EC、およびiPSC-CFから心臓ミクロ組織を生成するためには、心臓ミクロ組織内での接触阻害細胞圧縮後の細胞数をよりよく制御するために、高純度の培養物を得ることが不可欠である。最近、ジャコメッリら。al.18 は、iPSC-CM、iPSC-EC、およびiPSC-CFを用いた心臓微小組織の作製を実証している。記載された方法を用いて生成された心臓微小組織は、〜5,000個?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
アマンダ・チェイス博士の原稿に関する有益なフィードバックに感謝します。資金援助は、カリフォルニア大学T29FT0380(D.T.)および27IR-0012(J.C.W.)のタバコ関連疾患研究プログラム(TRDRP)によって提供された。米国心臓協会20POST35210896(香港)および17MERIT33610009(J.C.W.);国立衛生研究所(NIH)R01 HL126527、R01 HL123968、R01 HL150693、 R01 HL141851、およびNIH UH3 TR002588(J.C.W)。
Materials
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
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